產品簡介

已知，無論是生命科學研究還是生物制品生產，都會涉及到生物源材料的使用，其中包括來源于微生物、動物和人的細胞、組織、體液成分等。考慮到生產的藥物的安全性，需要對起始物料、生產工藝、生產環境等進行嚴格監控，防止有細菌、真菌等微生物污染。細菌內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上的結構，細菌在存活狀態時不釋放出來，但會在細菌死亡后的裂解大量釋放。微量的內毒素進入機體就能引起發熱休克等嚴重反應，從而影響生物制品的安全性。2020版《中國藥典》（三部）針對細菌內毒素檢測，收錄了包括凝膠法和光度法在內的共6種細菌內毒素檢查方法。

本產品就是采用凝膠法對內毒素進行定性或者半定量檢測的鱟試劑。由于，鱟試劑中含有C因子、B因子、凝固酶原和凝固蛋白原等。在適宜的條件下（如：溫度、pH值及無干擾物質等），細菌內毒素能激活C因子，引起一系列酶促反應，使鱟試劑產生凝集反應形成凝膠。

本鱟試劑為鱟科動物東方鱟血液中的變性細胞經裂解后提取到的一種細胞溶解物凍干品，其能與極微量的細菌內毒素形成特異性的凝膠反應，反應的速度和凝膠的堅固程度與內毒素濃度有關。

組分信息

儲存條件

2~8℃保存，有效期2年。

注意事項

1. 本產品僅作科研用途，僅供體外鱟試驗檢測，嚴禁用于人體。

2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本試劑前請仔細閱讀說明書，實驗應規范操作，包括細菌內毒素標準品溶解、稀釋及加樣。

4. 實驗過程中所用的器皿需經處理，以去除可能存在的外源性內毒素，常用的方法是干熱滅菌法（即250℃干烤≥30 min）；也可以采用其他確保不干擾內毒素檢查的方法。若使用塑料器械，應選用標明無內毒素并對試驗無干擾的器械。試驗操作過程應防止微生物的污染。

5. 需采用細菌內毒素國家標準品或工作標準品復核本鱟試劑的靈敏度值，應為標示值的50%~200%。

6. 本產品為一次性的試劑。

使用說明

1. 實驗前準備

1）提前準備實驗所需試劑和耗材：

如：細菌內毒素工作標準品(Cat#60451ES)、細菌內毒素檢查用水(Cat#60456ES10)、無熱原吸頭*和無熱原玻璃試管(Cat#60457ES)等。

*推薦您購買翌圣生物200 μL加長吸頭盒裝滅菌（Cat#83051ES）、1000 μL盒裝藍色無菌吸頭（Cat#83080ES）。

2）自備實驗所需設備和儀器：

如：渦旋振蕩器、250℃加熱和干燥烘箱、移液器、恒溫水浴鍋或干式恒溫金屬浴(37±1℃)等。

2. 實驗方法

1）準備超凈工作臺：

提前30 min開啟超凈工作臺，試驗操作過程中不要開啟風機，試驗完畢后用75%乙醇擦拭超凈工作臺。試驗操作過程應防止微生物和細菌內毒素污染。

2）溶解和稀釋細菌內毒素標準品：

a. 取1支細菌內毒素工作標準品（凝膠法檢測用）(Cat#60451ES)，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸上部劃痕，用75%乙醇擦拭后啟開，避免玻璃屑落入瓶內。

b. 按照工作標準品說明書，加入細菌內毒素檢查用水溶解，封口膜封口，置漩渦混合器上混勻15 min。然后加入細菌內毒素檢查用水進行稀釋，將其稀釋成2λ、λ、0.5λ和0.25λ等一系列濃度的內毒素標準溶液（λ為鱟試劑靈敏度標示值）。

c. 每步稀釋操作均需在渦旋振蕩器上混勻1 min。并且稀釋的內毒素溶液靜置時間超過10 min，用前也需在渦旋振蕩器上劇混勻1 min，放置4 h以上的內毒素溶液應丟棄。

3）準備供試品（即待測樣品）：

1. 所有與待測樣品或測試試劑直接接觸的材料均應無熱原。

2. 待測樣品的稀釋要在無熱原玻璃管中用無熱原水進行，避免微生物或內毒素污染；若不及時檢測，建議冷藏或冷凍保存。

3. 待測樣品的稀釋倍數應小于待測樣品的最大有效稀釋倍數，待測樣品最大有效稀釋倍數（MVD）的計算公式如下：

MVD=內毒素限度*（EU/mL）/測定靈敏度*（0.06 EU/mL）

*內毒素限度：未稀釋樣品中可接受的內毒素濃度最大值。

*測定靈敏度：測定試劑的低檢測限度（本試劑盒的低檢測限度為0.06 EU/mL）。

4. 對內毒素檢測無干擾*的樣品可直接用于檢測；對內毒素檢測有干擾（增強或者抑制）的樣品需稀釋至不干擾檢測的濃度，稀釋過程應充分漩渦震蕩≥2 min；通常內毒素檢測干擾是由于樣品中組分的濃度過高，因此大多數情況下，通過適度的稀釋甚至調節pH值克服對內毒素檢測的干擾。

*判斷待測樣品是否對內毒素檢測有干擾，可先進行干擾試驗，然后再開展鱟試劑的內毒素檢測實驗。

5. 待測樣品的pH*需維持在6~8之間。若樣品的pH值不在此范圍內，則需要使用無內毒素的氫氧化鈉、鹽酸或其它緩沖溶液進行調節。

*待測樣品不能直接進行pH調節，以免被pH電極污染內毒素導致假陽性，務必預實驗考察適宜的pH調節方法。

f. 除了內毒素，鱟試劑還與某些β-葡聚糖反應，產生假陽性結果。如遇含有β-葡聚糖的待測樣品，可使用去G因子鱟試劑或G因子反應抑制劑來排除鱟試劑與β-葡聚糖的反應。

4）實驗操作：

a. 溶解鱟試劑：取4支本凝膠法的鱟試劑（安瓿瓶裝）**，安瓿開啟過程同2.1).a.內毒素工作標準品。按每瓶上標示量各加入0.1 mL細菌內毒素檢查用水(Cat#60456ES)，輕輕振搖使鱟試劑全溶解*。

*注意不要引起氣泡，溶解后的鱟試劑應在10 min內使用（即配即用）。

**如果使用安瓿瓶操作不便，則可將4支溶解后的鱟試劑分別分裝在無熱原玻璃試管(Cat#60457ES)中。

b. 分別向上述4支裝有溶解了鱟試劑的安瓿瓶或者無熱原玻璃試管中加入0.1 mL陰性對照*、0.1 mL陽性對照**、0.1 mL待測樣品、0.1 mL待測樣本陽性對照。

*陰性對照：細菌內毒素檢查用水；

**陽性對照：濃度為2λ（即0.12 EU/mL）內毒素標準品溶液;

***待測樣本陽性對照：含2λ（即0.12 EU/mL）內毒素標準品溶液的待測樣本。

c. 封閉管口，輕輕搖勻，垂直放入37±1℃的恒溫器(水浴箱或干熱恒溫儀)中孵育60±2 min，孵育期間避免振動。孵育結束后，取出觀察結果。

5）結果判斷：

a. 將試管從恒溫器中輕輕取出，緩慢倒轉180°。若管內形成凝膠，且不變形也不從管壁滑脫，則為陽性，記錄為(+)；若管內未形成凝膠或雖生成凝膠但不能保持完整并從管壁滑脫，則為陰性，記錄為(一)。

b. 在陰性對照管結果為陰性，陽性對照管和供試品陽性對照管結果均為陽性的前提下，待測樣品的實驗結果才有效，否則實驗結果無效。

3. 鱟試劑靈敏度復核試驗

當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響實驗結果的改變時，應按《中華人民共和國藥典》2020版中《細菌內毒素檢查法》的“鱟試劑靈敏度復核試驗”進行試驗，具體操作如下：

1）根據本鱟試劑靈敏度的標示值（λ，即0.06 EU/mL），將細菌內毒素工作標準品*（凝膠法檢測用）(Cat#60451ES)先用內毒素檢查用水溶解，再稀釋成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個濃度梯度。

*細菌內毒素工作標準品的安瓿開啟過程和超凈工作臺準備過程、實驗注意細節等同2.實驗方法。

2）取本凝膠法鱟試劑（安瓿瓶裝）18支，每支加入0.1 mL內毒素檢查用水溶解*，搖勻，然后將其混勻。

*鱟試劑復溶后不能放到漩渦混合器上混合，因為強烈混合容易使復溶后的鱟試劑產生泡沫，影響凝膠的形成。

3）將上述18支鱟試劑按下表進行分組加不同濃度的內毒素標準品和內毒素檢查用水：

表1 鱟試劑靈敏度復核試驗樣品配制

*每次加樣濃度必須是從高到低，加不同濃度的樣品需更換新的移液器吸嘴。

圖1 鱟試劑安瓿排列圖*

*圖中1、2、3、4、5列對應上表中的組1、組2、組3、組4、組5。

4）加樣結束后，用封口膜封口，將鱟試劑安瓿中溶液輕輕混勻，應避免產生氣泡，連同試管架垂直放入37±1℃的恒溫水浴箱中*，試管架保持水平狀態，保溫60±2 min。

*使用溫度計監測恒溫水浴箱溫度是否滿足實驗要求，每30 min進行溫度記錄。

5）結果判斷及計算：

a. 將鱟試劑安瓿從恒溫器中輕輕取出，緩慢倒轉180°。若管內形成凝膠，且不變形也不從管壁滑脫，則為陽性，記錄為(+)；若管內未形成凝膠或雖生成凝膠但不能保持完整并從管壁滑脫，則為陰性，記錄為(一)。

b. 在陰性對照管結果為陰性，陽性對照管和供試品陽性對照管結果均為陽性的前提下，待測樣品的實驗結果才有效，否則實驗結果無效。

c. 當最大濃度2λ的4個重復管均為陽性，低濃度0.25λ的4個重復管均為陰性，陰性對照的2個重復管也為陰性，試驗才算有效。

d. 按下式計算反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值(λc)。

λc=antilg（∑X/n）

X：反應終點濃度的對數值(lg)。反應終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度。

N：每個濃度的平行管數（或重復管數）。

當λc在0.5~2λ(包括0.5λ和2λ)時，方可用于細菌內毒素檢查，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

4. 干擾實驗

當供試品中可能存在鱟試驗的干擾物質時；當鱟試劑、供試品的來源、配方、生產工藝或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時；當對新藥或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時；都必須按《中華人民共和國藥典》2020版中《細菌內毒素檢查法》的“干擾試驗”進行干擾試驗。具體操作如下：

1）按表1制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過最大有效稀釋倍數(MVD)的溶液，按鱟試劑靈敏度復核試驗開展下述操作。

表2 凝膠法鱟試劑干擾試驗溶液的配制

*A：為供試品溶液；

**B：為干擾試驗系列；

***C：為鱟試劑標示靈敏度對照系列；

****D：為陰性對照。

2）當溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結果符合鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，試驗方

為有效。

3）當系列溶液B的結果符合鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。若出現其他情況，則認為供試品在該濃度下存在干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋*，再重復干擾試驗。

*可通過對供試品進行更大倍數的稀釋或通過其他適宜的方法(如過濾、中和、透析或加熱處理等)排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內毒素失去活性，要使用預先添加了標準內毒素再經過處理的供試品溶液進行干擾試驗。