晝夜節律廣泛存在于地球上的生物體中，在生物體響應環境的晝夜變化、維持生理穩態和健康中發揮著重要作用。晝夜節律紊亂可能會引發睡眠障礙、免疫力下降等疾病，威脅到人類健康。

在20世紀90年代，研究發現并提出，在晝夜節律的分子機制中，生物鐘（circadian clock）扮演著極其關鍵的角色。生物鐘是生物體內調控生理和行為節律（約24小時周期）的核心機制，它通過轉錄-翻譯負反饋環路（transcription–translation feedback loop，TTFL）的形式實現計時功能，此分子機制在真核生物中高度保守。

（1）轉錄因子與DNA啟動子區域的順式元件結合，激活靶基因（包括自身抑制因子）的表達；

（2）抑制蛋白在胞質中積累并轉位至細胞核；

（3）核內抑制蛋白與轉錄因子相互作用，抑制其自身轉錄，形成約24小時的周期性振蕩。

這種TTFL模型，在多種真核生物鐘系統中具有普遍適用性。但隨著研究的深入，發現該TTFL模型面臨諸多挑戰：①雖然該TTFL模型機制在真菌、植物和動物等不同物種中表現出相似的結構特征（結構保守），但分子組成成分缺乏同源性（獨立進化），暗示可能來源于不同的起源。②轉錄和翻譯過程需要消耗細胞約75%的能量，TTFL模型如何克服能量代謝障礙來維持高度有序的晝夜節律振蕩，目前還沒有解釋清楚。因此，研究試圖尋找并解釋真核生物鐘的分子機制，并探究真核生物與原核生物鐘的潛在共同特征。

文章揭示了P-loop NTP酶家族成員（AAA+（ATPases Associated with diverse cellular Activities））RUVBL2（又名RuvB-like 2）是真核生物中保守的時鐘成分，是真核生物鐘的共同核心成分，闡述了RUVBL2通過能量依賴的NTP酶活性調控生物鐘的分子機制，并證實了其在真核生物晝夜節律系統中具有進化保守的核心調控功能。與藍藻生物鐘核心蛋白KaiC類似，RUVBL2表現出穩定的低活性ATP酶特性，其催化效率（約13個ATP分子/天），較常規ATP酶（103-10?個ATP分子/天）顯著降低。這一發現也支持了最初在藍藻中發現的“緩慢ATP酶活性是生物鐘共同特征”的這一觀點。

圖2.循環振蕩系統的起源模型。該示意圖顯示了所研究的每個生物體的起源，起源于最后一個普遍共同祖先（LUCA）。周期長度受KaiC或RUVBL ATP酶活性的調節（論文鏈接：doi.org/10.1038/s41586-025-08797-3）

提出全新假設：在遠古生命起源階段，隨著原始生物鐘的出現，低活性的 P-loop ATP 酶成為生物鐘系統的核心組件。在藍藻中，KaiC 結合 KaiA 和 KaiB 組成了一個連接到 TTFL 的強大振蕩器，而在真核生物中，含有 P 環的 AAA+ ATP 酶 RUVBL2 及其同源蛋白通過與 TTFL 生物鐘蛋白相互作用，參與生物鐘調控。KaiC 和 RUVBL2 極低的 ATP 酶活性共同決定了生物鐘的 24 小時節律振蕩，這一機制或許是生物鐘系統進化的共同特征。研究團隊并對這一假設進行一系列的實驗設計和論證。

• 免疫共沉淀（Co-IP）與蛋白質組學分析顯示，RUVBL2與生物鐘核心復合物（如CLOCK/BMAL1、PER/CRY）存在物理相互作用。

• 染色質免疫沉淀（ChIP）分析RUVBL2對CLOCK/BMAL1靶基因（如Per、Cry）啟動子結合的調控，RUVBL2通過維持時鐘蛋白復合物的動態組裝（如促進PER/CRY降解或CLOCK/BMAL1的激活），直接調控TTFL的周期性振蕩。

• RUVBL2的NTP酶活性可能作為細胞內能量狀態的傳感器，將代謝信號（如ATP/ADP比率）與生物鐘調控偶聯，解釋生物鐘如何響應營養或能量脅迫。

研究團隊通過系統性遺傳篩選，獲得了RUVBL2的三種功能突變體：節律紊亂型、周期縮短型、周期延長型。將這些突變體通過腺相關病毒載體遞送至小鼠視交叉上核（SCN）后，可顯著改變其自主運動活動的晝夜節律模式。

生化分析證實這些表型變異均與ATP酶活性改變直接相關。酶動力學分析表明，野生型RUVBL2的ATP水解活性極低，每日僅催化約13個ATP分子水解，其周轉率較典型ATP酶顯著降低。

RUVBL2 作為保守的低活性 ATP 酶，在調控真核生物鐘周期方面發揮了關鍵作用，在人類、果蠅和真菌等不同真核生物鐘系統中均得到驗證：①RUVBL2直系同源物與各物種核心時鐘蛋白存在保守的物理相互作用；②跨物種的RUVBL2突變均導致一致的節律表型。

使用抗癌藥物 CB-6644 抑制 RUVBL2 活性，可劑量依賴性延長晝夜周期，為新型生物鐘調節劑的開發提供新的方向。

綜上所述，該研究不僅確立了RUVBL2在真核生物晝夜節律系統中的核心地位，證實了 RUVBL2 作為核心生物鐘組分的作用，也揭示了慢速ATP酶活性這一最初在藍藻時鐘中發現的特征性機制，如何以類似 KaiC 的機制調節真核生物的晝夜節律，證實了其在真核生物中同樣具有進化保守性，為理解生物鐘的分子進化提供了新視角。

這一發現豐富了真核生物鐘的分子調節機制，深化了對生物鐘能量耦合機制的理解，也為靶向晝夜節律紊亂的干預策略提供了新思路，在進化生物學和生物鐘研究領域具有重要意義。

將野生型或突變的同源基因組克隆至攜帶潮霉素B抗性（# 60225ES，Yeasen Biotechnology）的PBS質粒中，該質粒攜帶潮霉素B基因，用于后續篩選。