實驗步驟    

基 本 方 案 1 多克隆抗磷酸肽抗體的制備

材料

B S A -瓊 脂 糖 親 和 基 質（Sigma) 填 裝（如輔助方案 2 ) 于柱床體積IOml的層析柱

磷酸化酪氨酸親和基質層析柱（IOml 柱床體積；見輔助方案3)

磷酸肽-B S A 偶聯物免疫家兔的粗制血清

PB S /疊氮鈉.•含有0.02% (m /V ) 疊氮 鈉 的 PBS (附 錄 1 ) ( 可長期保存于4°C 或室溫）

3m ol/L NaSCN

同種非磷酸肽親和基質層析柱（3m l 柱床體積；見輔助方案1 和 2)

同源磷酸肽親和基質層析柱（可選； 3m l 柱床體積；見輔助方案1 和 2)

陽性選擇的磷酸肽親和基質層析柱（3m l 柱床體積；見輔助方案1 和 2)

3.5m ol/L 和 4. 5m ol/L MgCl2 (可選）

透 析 袋（M W C O 12 000?14 0 0 0 ; 寬 10m m ，直徑 6. 4m m ; 如 Spectrum 的 Spectra/Por 4)

注 ：所有以下的層析步驟均在室溫下進行，液體均以重力作用上柱。

1 . 將洗滌后的B S A -瓊脂糖與磷酸酪氨酸親和基質層析柱相連。

2 . 將 15m l 的粗制血清通過重力作用流過兩柱，以 PBS/疊氮鈉洗，直到所有黃色血清均 通 過 層 析 柱（或以分光光度計測流出液的A 28。吸光度，直至達到基線）。再 以 5?IOml P B S /疊氮鈉洗柱，收集所有穿出液，其中可能含有目的抗體。

每 一 次 過 柱 后 血 清 的 體 積 會 增 加 ， 這 將 延 長 下 一 次 過 柱 的 時 間 。 如 果 通 過 觀 察血 清 的 黃 色 程 度 來 確 定 液 體 流 穿 的 進 程 ， 則 血 清 越 被 稀 釋 后 就 越 不 容 易 觀 察 。

3 . 可選：留取部分粗制血清組分及*次的穿出液，用于后續分析及對比每一次純化的組分。如果有必要，可立即通過免疫印跡對含有多種磷酸化酪氨酸蛋白的樣本進行 分 析（單 元 12. 5)，以排除無反應的組分。也可以留取部分純化的組分用于接下來的分析，然后繼續下一步驟。

4 . 血清過柱后，以 1 0 倍柱床體積的3mol/L N a S C N 和 10倍柱床體積的P B S /疊氮鈉再生柱子， 4°C 保 存 于 P B S /疊氮鈉中備用。

5 . 將穿出的血清組分盡量多次過同種非磷酸肽親和基質柱，以盡量減少交叉反應。以10倍柱床體積的3mol/L N a S C N 和 1 0 倍柱床體積的PBS/疊氮鈉再生柱子。分析每次或多次過柱的血清或保留部分組分待以后分析。

6 . 如果預期與同源的磷酸蛋白有交叉反應，則 使 用 步 驟 5 中提供的方法使穿出的血清組分通過同源磷酸肽親和基質柱。

7 . 在收集陽性選擇親和純化的穿出峰之前，將 25c m 的透析袋水化并洗滌。透析袋一端用透析夾夾緊，檢查是否滲漏，配 制 6L PBS/疊氮化合物， 4°C 保存用作透析液。

8 . 將上次層析步驟所得到的流穿血清通過陽性選擇的磷酸肽親和基質柱3 次（使抗體親和基質的相互作用zui大化），在每次之間不需洗柱。

9 . 收集zui后一次穿出的血清，用 5?20m l 的 P B S /疊 氮 鈉 洗 柱（根據柱前體積和柱床體積），將洗滌物與流穿的血清合并，另 用 20m l 的 P BS/疊氮鈉洗柱，收集流穿液體作為 「洗滌」峰 。

10.以多種促溶劑洗脫：可 以 選 用 20m l 3mol/LNaSCN (*選擇）或 10m l 3.5mol/LMgCl2 (可能會產生沉淀，減慢流速）洗脫后加I O m U .5mol/L MgCl2洗脫。開始洗脫時，立即收集每份3m l 洗脫液到步驟7 中準備的透析袋中，用透析夾將近端的袋口夾緊并立即投入PBS/疊氮鈉透析液中。或者也可以收集3m l 洗脫液到透析管中，一旦收集每一組分完畢，立即將透析液加人透析管中。收集至少6 個 組 分（大多數抗體在前 3 個組分中， 2?3 個柱床體積），如前所述再生柱子（步 驟 4)。

11.在 P B S /疊氮鈉中于4°C 對 步 驟 1 0 收集的所有組分進行*透析。

12.檢 測 280n m 吸光度或用蛋白比色法測定透析后組分的蛋白質濃度，并 計 算 產 量（15 ml血清得到> l m g 純化抗體）。分裝抗體保存于一70°C ，正在使用的抗體保存于4°C 。

13.用 ELISA (單元L I ) 或 免 疫 印 跡（單 元 12. 5 ) 分析zui終樣本以及以前步驟中保存的純化組分的反應性和交叉反應性。

基 本 方 案 2 制備抗磷酸肽的單克隆抗體

材 料（帶V 項 目 見 附 錄 1)

融合后的候選雜交瘤細胞系（單 元 1.3)

D M E M /H T *培養基

篩選稀釋液

同種磷酸肽-B S A 偶 聯 物（作 為 E L I S A 抗原；輔助方案1 和 單 元 13. 1、單 元 13. 3)

陰性對照：用于制備雜交瘤細胞系小鼠的免疫前血清

陽性對照：用于制備雜交瘤細胞系小鼠的免疫血清

同種非磷酸酪氨酰基肽-B S A 偶 聯 物（作 為 E L I S A 抗 原 ；單 元 13.1、單 元 13.3)

非同種磷酸酪氨酰基肽-B S A 偶 聯 物（作 為 E L IS A 抗原 ；單 元 13.1、 單 元 13. 3)

B S A 偶聯的同源磷酸肽（可選；作 為 E L IS A 抗原；單 元 13.1、 單 元 13. 3)

9 6 孔聚苯乙烯組織培養板

網格記錄紙

1 . 用 H T 培養基將融合的候選雜交瘤細胞系以低密度（目的是達到每3 個 孔 1 個細胞）接 種 于 9 6 孔聚苯乙烯組織培養板（單 元 1.3)， 2 周左右測定，通 過 記 錄 9 6 個網格記錄紙上每個孔上的克隆數目來鑒定所有單克隆雜交瘤培養孔，作為可能的候選株，為便于鑒別，在每個含有單個克隆的孔的下方做標記。

2 . 使用無菌技術，從每個可能候選株的孔中移出等份上清（如 從 2 0 0 4 中 移 出 IOOm I)至另一個9 6 孔 板（篩選板）中，在網格記錄紙上記錄原始板的編號、孔的位置以及相對應板的編號、孔的位置。原始孔每孔再補加以100ul， 37°C 預熱的新鮮H T 培養基 。如果需要，用亮色的孔狀大小的膠貼粘貼在板蓋表面以示標記。如果上清沒有立即進行檢測，則將篩選板塑料袋包好存放于4°C 。

3 . 篩選板中每孔上清液加入150ul 篩 選 稀 釋 液（防止微生物污染并擴大體積）。

4 . 以同種非磷酸肽-B S A 偶聯物為抗原進行ELISA (單 元 1.1)，對篩選板中每一候選雜交瘤上清的部分組分（如 50M1 ) 進行篩選。記錄每個陽性樣本篩選板的編號、孔的位置以及相對應的原始板編號、孔 的 位 置 ，同時測定融合用小鼠的免疫前血清(陰性對照）和 同 一 只 小 鼠 的 免 疫 血 清（陽性對照），在 H T 培 養 基 ：篩選稀釋液1 : 1 混合液中按1 : 1 0 0 稀釋 。同時也對空白篩選稀釋液進行E L I S A 檢 測（作為附加的陰性對照）

。

5 . 以同種非磷酸肽-B S A 偶聯物為抗原，順次或同時對步驟4 篩選出的每個陽性樣本的部分組分進行ELISA (單 元 1 . 1 ) 檢 測 ，以剔除非磷酸化反應性的克隆；以非同種無關磷酸酪氨酰基肽-B S A 偶聯物為抗原進行 E L IS A 檢 測 ，以剔除具有其他磷酸酪氨酸反應性的克隆。此外，如果預期可能與同源磷酸化蛋白有交叉反應，則 以 BSA偶聯的同源磷酸肽為抗原以剔出任何可能的同源磷酸化蛋白交叉反應。如果有必要，也可以同時篩選具有非磷酸化同種肽的特異反應性的克隆。

6 . 將克隆擴大培養，以滿足篩選所需的所有試驗。冷凍部分組分備用。通過有限稀釋(單 元 1 . 3 ) 對剩余的細胞進行亞克隆。

7 . 如 步 驟 4 和 5 , 篩選亞克隆的上清，檢測抗體的持續分泌和特異性。將具有代表性的獨立亞克隆與其原始的母代克隆區分開來，因為難以預測每個母代單克隆抗體是否能夠識別同種磷酸化全蛋白，或者能否用于日后的各種類型免疫檢測。擴大培養和凍存候選亞克隆。經過多輪傳代和凍存、復蘇、再擴大培養后，連續檢測抗體的特異性和分泌持續性（推薦）。

8 . 進一步對亞克隆進行鑒定，選取zui有用的克隆，分析培養上清液在特定的免疫檢測(如免疫共沉淀，如 單 元 12. 2 中所述；或免疫印跡，如 單 元 12. 5 中所述）中與同種磷酸化全蛋白的反應性。

9 . 可選：將目的克隆大量培養獲取培養上清制備抗體，并 進 行 親 和 純 化（見基本方案1)，或 制 備 腹 水（單 元 1.4)，腹水可通過硫酸銨沉淀而后進行親和純化。如果有必要 ，可以利用商業化的試劑盒（如 Pierce或 Sigma) 進行亞型分析。

輔 助 方 案 1 肽的合成

目前，大多數含磷酸酪氨酰基的肽是利用9-芴 甲 氧 羰 基（Fmoc) 磷酸酪氨酸合成的。由于在磷酸酪氨酸上缺乏一個側鏈保護性基團（Kitas^ d . ， 1994)，標 準 F m o c 合成和裂解步驟才得以應用（Chang and Meienhofer， 1978); 然 而 ，要想達到氨基酸的有效偶聯，在加入未保護的磷酸酪氨酸后，需要比標準步驟用量更高的超濃度的活化F m o c 氨基酸。在有些情況下，需要用雙偶聯法，即在加入磷酸酪氨酸之后再加入少量其他氨基酸以延長肽鏈。這種替代方法需要按合成肽的要求，有順序地、反復加入下一個氨基酸。在本單元中闡述將肽偶聯到親和基質上的方法（見 輔 助 方 案 2)，將肽段偶聯到載體蛋白的常用方法將在單元13. 1 和單 元 13. 3 中闡述。

輔 助 方 案 2 肽 段 偶 聯 到Affi-G d 1 0 親和性基質

此方案描述了將磷酸肽和非磷酸肽偶聯到Affi-Gel 1 0 親和性基質上的方法，用于抗體的親和柱層析純化。這一步驟可生成3m l 終末柱床體積的親和性樹脂，每毫升凝膠 偶 聯 3umol肽 。

材料

用于偶聯的合成寡肽（見輔助方案1)

二 甲 基 亞 砜（D M S O )

iV-甲 基 嗎 啉（9 9 % 純度； AcrosOrganics)

Affi-Gd 10 (Bio-Rad) 或類似活化支持基質

氨基乙醇

0.lmol/L 氨基 乙 醇 •H C 1， p H 8. 0

高鹽/髙 p H 溶液••0 •5mol/L NaCl/0. 4 % (m A O 碳酸氫鈉

高鹽/低 p H 溶液： 0.5mol/L N a C l /100 mmol/L 乙酸鈉， p H 4.2

PB S /疊氮鈉：含 有 0.02% (m /V ) 疊氮鈉的PBS (附錄1)

0.5mol/L NaCl

3mol/L NaSCN

聚丙烯螺旋蓋離心管

直 立 圓 筒（end-over-end) 搖床

真空吸引器

玻璃層析柱，容量> 5 ml (Bio-Rad) ，或 帶 有 1-cc硅 化 玻 璃 棉 塞 子 的 5m l 塑料注射器

1 . 將 合 成 寡 肽 按 0.5?4 倍 所 需 柱 床 體 積 的 容 量 比 溶 解 于 D M S O 。例 如 ， 9 Mm o l 肽(15. 3m g ，對于一個平均15m e r 分子質量為1700的肽）對 應 3m l 柱床體積。

2 . 按如下操作小心滴定以中和肽溶液：以 1?2ul增量加入肽合成級N -甲基對氧氮己環(高濃度或在D M S O 中稀釋到1 : 1 ?1 : 9 ) ，每次加入后移出 2?3ul等 份 ，將其用50ul水稀釋，然后點在 p H 試紙條上。重復這一步驟，直 到 p H 達 到 7?8 (基本上每 3 umol肽 需 要 7?8ul，取決于氨基酸序列）

3 . 充分混勻 Affi-Gd 1 0 親和性基質瓶中的內容物，使樹脂懸浮，然后將所需體積的樹脂[2 倍 于 柱 體 積（4 倍 于 5 0 % 混 懸 物）的 樹 脂 ] 移 至 聚 丙 烯 螺 旋 蓋 離 心 管 ，在D M S O 中 洗 3 次 ，每次在室溫下以700 g 轉 速 離 心 5 min。吸出上清液，以 5 倍體積D M S O 重懸樹脂，然后再次以700 g 轉速離心。不要超過推薦的轉速進行離心，否則可能破壞樹脂。

4 . 從樹脂中吸出過量的D M S O , 加 入 步 驟 2 制備好的肽溶液，在室溫下用直立圓筒振蕩器孵育。每 毫 升 樹 脂 加 入 純 氨 基 乙 醇（消除未反應的酯基團），在室溫下用直立圓筒搖床孵育2 h ，如 步 驟 3 在 D M S O 中洗 2 次 。

5 . 如 步 驟 3 在 p H 8. 0 的 0. lmol/L氨 基 乙 醇 •H C l 中 洗 2 次（第 1 次要在冰上進行，因為會產生大量熱量），第 2 次洗滌后移出O.lmol/L氨 基 乙 醇 ^ H C l , 更換新溶液，在 4°C 下用直立圓筒搖床孵育，然后低速離心并吸出上清液。

6 . 利用步驟3 中描述的方法，用高鹽/高 p H 溶 液 洗 3 次 、高鹽/低 p H 溶 液 洗 3 次 、P BS /疊氮鈉洗3 次 ，洗滌后的樹脂保存于4°C ，直至裝于層析柱。

7 . 用 O.5mol/L N a C l 將基質混合為混懸物，然后灌入玻璃層析柱或帶有1-cc硅化玻璃棉塞子的5m l 塑料注射器底部，先 后 用 1 0 倍 于柱體積的3m d / L N a S C N 和 1 0 倍于柱體積的P B S /疊氮鈉洗滌每個層析柱。

輔 助 方 案 3 磷 酸 酪 氨酸 偶 聯到Affi-G d 1 0 親和基質

此步驟可生成IOml終末柱床體積的親和性樹脂，每毫 升 Affi-Gd 1 0 偶 聯 3 umol 磷酸酪氨酸。

材料

磷酸酪氨酸

0.4% (m /V ) 碳酸氫鈉

lmol/L N a O H (可選）

氨基乙醇

0 •lmol/L 氨 基 乙 醇 •H C 1， p H 8. O

燒結玻璃漏斗和真空吸引器

玻璃層析柱，容量> 1 4 ml (Bio-Rad)

1 . 將磷酸酪氨酸按 0.5?4 倍的預期柱床體積的容量比溶解于 0 . 4 % 碳酸氫鈉。例如 ，30umol 磷 酸 酪 氨 酸（7.8m g ，對于相對分子質量為 2 6 1 的磷酸酪氨酸）對 應 IOml柱床體積。如果簡便些，可以多用些磷酸酪氨酸，因為它相對比較便宜。

2 . 用 p H 試紙條測定 p H 達 到 7?8。如果有必要調整，可通過滴定來中和溶液，如加入 少 量 l m d /L N a O H ，每次加入后移出2?3jlJ 等份 ，然后點在p H 試紙條上。重復這一步驟直到 p H 達 到 7?8。

3 . 充分混勻Affi-Gel 1 0 親和基質瓶中的內容物，使樹脂懸浮，然后將所需體積的樹脂[2倍 于 柱 體 積（4 倍 于 5 0 % 混懸物）的樹脂]移至連接真空抽吸器的玻璃陶瓷漏斗。洗 3 次 ，每次向樹脂上灌入冷蒸餾水后進行抽吸，然后以同樣方法用冰冷的 0 . 4 % 碳酸氫鈉洗滌zui后一次。

4 . 用真空抽吸從凝膠中吸出大部分多余的液體，不必使其*干燥，將其移至螺旋帽離心管，加入步驟 2 備好的磷酸酪氨酸溶液，樹 脂 從 瓶 中 移 出（步 驟 3 ) 到與磷酸酪氨酸溶液混合的時間間隔不要超過 20min。在 4°C 下用直立圓筒搖床孵育。

5 . 每毫升樹脂加入 2ul 純 氨 基 乙 醇（消除未反應的酯基團），在室溫下用直立圓筒振蕩器 孵 育 2 h 。洗樹 脂 2 次 ，每 次 低 速 離 心（見輔助方案2 , 步 驟 3 ) 并吸出上清液，以5 倍 體 積 0 . 4 % 碳酸氫鈉重懸樹脂，然后再次低速離心。

6 . 如 步 驟 4 在 p H 8. 0 的 0. lmol/L 氨 基 乙 醇 •H C l 中 洗 2 次 ，第 2 次洗滌后移出0.lmol/L 氨 基 乙 醇 . H C l ，更換新溶液，在 4°C 下用直立圓筒搖床孵育，然后低速離心并吸出上清液。洗滌 、保存、填 裝 樹 脂 于 層 析 柱 中（見 輔 助 方 案 2 , 步驟

7)。