人環(huán)孢素A(CsA)ELISA試劑盒

人環(huán)胞霉素A（CSA）酶聯(lián)免疫分析

試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用

人環(huán)孢素A(CsA)ELISA試劑盒

預期應用

ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關液體中環(huán)胞霉素A（CsA）含量。

實驗原理

環(huán)孢霉素A（cyclosporin A, CsA）系含11個氨基酸的環(huán)狀多肽,是一種強效免疫抑制劑,對T淋巴細胞亞群具有選擇性抑制作用,同時還抑制白細胞介素2、T細胞生長因子（TCGF）等細胞因子的釋放。

本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中CSA水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入CSA抗原、生物素化的抗人CSA抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CSA呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

人環(huán)孢素A(CsA)ELISA試劑盒

試劑盒組成及試劑配制

1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔）

標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為1000 ng/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成1000 ng/mL，500 ng/mL ，250 ng/mL，125 ng/mL，62.5 ng/mL，31 ng/mL，15.6 ng/mL，其原液直接作為zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/mL，臨用前15分鐘內配制。

如配制500 ng/mL標準品：取0.5ml 1000 ng/mL的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

2. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

3. 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

4. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

5. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。

6. 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

7. 底物溶液：1×10ml/瓶。

8. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

9. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

標本的采集及保存

1．血清：標本請于室溫放置2小時或4℃經(jīng)過一夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

2．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

人環(huán)孢素A(CsA)ELISA試劑盒

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫。

1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標板加上蓋，37℃反應120分鐘。

2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。

3. 每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。

4. 每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。

5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）。

6. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時蘭色立轉黃色）。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

注：人環(huán)孢素A(CsA)ELISA試劑盒

1． 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內。

洗板方法

手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將*的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。

自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

本試劑盒可同時檢測重組或天然的人CSA，且與其它相關蛋白無交叉反應。

計算

以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1． 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2． 一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數(shù)量多，*使用排槍加樣。

3． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。

4． 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5．在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

6．底物請避光保存。

檢測范圍：

15.6 ng/mL -1000 ng/mL

人環(huán)孢素A(CsA)ELISA試劑盒

說明

1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結果。

2. 小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本 / 標準品，酶結合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。而且，洗滌不充分將影響試驗結果。

3. 試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃，部分試劑保存于2-8℃，具體以標簽上的標示為準。

4. 濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

5. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現(xiàn)象，不會對實驗結果造成任何影響。

6. 中、英文說明書可能會有不*之處，請以英文說明書為準。

7. 所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

8. 有效期：6個月

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