實驗開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進冰槽里融化。然后進行下列操作。 一、 樣品準備 1. 準備好 25cm2細胞培養瓶或 60mm細胞培養皿的待測培養細胞(5 X 106細胞) 2. 小心加入 xx 毫升預冷的 SBJ 清理液(試劑 A),覆蓋生長表面 3. 小心抽去清理液 4. 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞 5. 加入 xx 毫升 SBJ 清理液(試劑 A),混勻細胞 6. 移入到預冷的 15 毫升錐形離心管(注意:懸浮細胞從這一步驟開始) 7. 放進 4℃臺式離心機離心 5 分鐘,速度為 300g 8. 小心抽去上清液 9. 加入 xx 微升S B J 裂解液(試劑 B),充分混勻 10.轉移到預冷的 1.5 毫升離心管 11.強力渦旋震蕩 15 秒 12.置于冰槽里孵育 30 分鐘 13.放進 4℃微型臺式離心機離心 5 分鐘,速度為 16000g(或 13000RPM) 14.小心移取 500 微升上清液到新的預冷的 1.5 毫升離心管 15.移取 2 微升進行蛋白定量測定 16.即刻放進-70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作 二、細胞活性定磷比色法定量檢測試劑盒測定準備 1. 準備好待測樣品(例如細胞裂解萃取液等),置于冰槽里(注意:樣品須澄清) 2. 設定好分光光度儀(溫度為 30℃):波長為 660nm,并置零 3. 準備好 5 個 1.5 毫升離心管,標記為 1 至 5 號管 4. 按下表分別加入S B J 陰性液(試劑 D)和 SBJ標準液(試劑 H)到每個離心管, 混勻. 5. 將 1 至 5 號管放進冰槽里備用,避免光照;標準管濃度見下表: 管號 SBJ陰性液(試劑 D) SBJ 標準液(試劑 H) 測定體系標準磷濃度 1 0 xx 微升 20 微摩爾/升 2 xx 微升 xx 微升 15 微摩爾/升 3 xx 微升 xx 微升 10 微摩爾/升 4 xx 微升 xx 微升 5 微摩爾/升 5 xx 微升 0 0 |