除蟲菊酯酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

1工作液準(zhǔn)備

1.1 除蟲菊酯（Pyrethrins）標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0ng/ml, 0.025ng/ml,0.1ng/ml,0.25ng/ml,1ng/ml,4ng/ml

1.2 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20（1+19）稀釋備用

1.3 樣本稀釋液：用蒸餾水按1:10（1+9）稀釋備用

1.3 顯色劑：已備用，避免光線直照

1.4 反應(yīng)終止液：已備用

2 樣品處理程序（樣品在提取過程中，要嚴(yán)格按說明書操作，提取過程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋，否則會出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）

2.1取10g粉碎的樣品，加 20ml 70%甲醇溶液

2.2強(qiáng)力振蕩3分鐘

2.3用Whatman 濾紙過濾

2.4取25μl處理后的樣品，加入25μl樣本稀釋液于反應(yīng)孔中（樣本稀釋倍數(shù)為2）

3 酶免分析步驟

3.1 實(shí)驗(yàn)須知

3.1.1 實(shí)驗(yàn)開始前請將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃），時(shí)間約2小時(shí)。回溫至室溫（25±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存。注：一定保證回溫充分，否則影響檢測的度和準(zhǔn)確度。

3.1.2 使用后請立即將試劑放回2~8℃保存

3.1.3 請不要改變分析程序

3.1.4 請使用的微量移液器

3.1.5 操作一旦開始，請不要中斷任何程序

3.1.6 ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序，請嚴(yán)格按照要求操作

3.1.7 為避免交叉污染，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣

3.1.8 加樣時(shí)請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面

3.2 分析步驟

3.2.1 預(yù)*行編號，標(biāo)記B0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，推薦進(jìn)行雙孔檢測

3.2.2 取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存

3.2.3 樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液（蒸餾水或去離子水稀釋）

3.2.4 在B0孔中加入50μl0.0 ng/ ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液

3.2.5 在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液

3.2.6 在各樣品孔中加入50μl樣品溶液

3.2.7 在所有孔中加入50μl的抗除蟲菊酯（Pyrethrins）抗體酶結(jié)合物

3.2.8 輕輕晃動反應(yīng)板幾秒鐘。

9.3 37℃溫浴30min （溫浴過程中不時(shí)輕拍反應(yīng)板，可以減少雙孔誤差）

3.3.1 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。

3.4 反應(yīng)

3.4.1 洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個(gè)微孔中先加入50μl顯色液A，再加 50μl顯

色液B；輕微晃動反應(yīng)板使之*混勻

3.4.2 37℃溫浴10min

3.4.3 每孔中加入50μl終止液，混勻

3.4.4 在450nm下檢測吸光度，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。

4 結(jié)果計(jì)算

4.1定量分析

4.1.1所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

4.1.2以除蟲菊酯（Pyrethrins）濃度的對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)樣品百分吸光度值，可從曲線上得到對應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為除蟲菊酯（Pyrethrins）濃度的對數(shù)值，求得反對數(shù)即為測定液中除蟲菊酯（Pyrethrins）濃度C（ng/ml）

4.1.3由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。

4.2 半定量測定

4.1.1目測半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。

4.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。

5 特異性

物質(zhì) 交叉反應(yīng)

除蟲菊酯（Pyrethrins） 100%

6 試劑盒參數(shù)

本試劑盒檢測下限為0.05 ng/ml

B0吸光度*值應(yīng)大于1.0

試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％，板間誤差小于15％。

用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％。

7 標(biāo)準(zhǔn)曲線模式（僅供參考）

試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0ng/ml~4ng/ml

8 分析限制

本試劑盒檢測為陽性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。