酵母菌是果酒釀造中主要的功能性微生物，根據其在釀造過程中功能不同而分為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Sc）和非釀酒酵母。Sc具有較高的產酒能力與耐受性，在發酵過程中大多會占據優勢并完成發酵；非釀酒酵母則能產生更加復雜的風味成分以及胞外酶等代謝物，可以將原料中的物質充分釋放，將其轉化為高級醇、酯等香氣物質，提升果酒的品質。因此，將Sc和非釀酒酵母用于混合發酵果酒，能將原料中的風味更好地展示出來。

非釀酒酵母中有一類酵母菌在其生長過程中能產生較多的酯類香氣成分及其前體，這類酵母菌可以叫做產酯酵母或產香酵母。產香酵母近年來被應用于很多食品的生產，如面食的發酵、醬油、食醋、白酒以及果酒的釀造中，使香氣復雜化，具有提升產品品質的能力。但非釀酒酵母乙醇發酵能力較弱，常常不能將之用于純種發酵。近年來很多研究將Sc和產香酵母混合發酵，但在混合發酵時，需要研究混合發酵過程中的相互作用關系和規律，才能更好地控制發酵各個階段的菌種特性和代謝，優化生產發酵工藝。

本實驗以前期篩選出的2 種優良酵母菌株為研究對象，對其進行單菌種及混合培養，通過考察混合發酵時生長變化規律，分析相互作用中細胞凋亡、代謝物以及細胞接觸作用，一方面旨在對酵母菌相互作用機理及發酵動力學有更加深入的認識，另一方面在混合發酵工藝提升產品風味的基礎上，更加準確調控微生物的生長和代謝，使得生產更加系統化。

一、材料與方法

1、材料與試劑

（1）菌種與培養基

Sc ZM-005為從自然發酵藍莓酒中篩選出來的1 株產酒能力優良且能在WL鑒別培養基呈現顏色和形態的酵母菌；Wa K-008由貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室鑒定保藏。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固體培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉10 g/L，瓊脂15 g/L，蒸餾水100 mL，115 ℃滅菌20 min；YPD液體培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉10 g/L，蒸餾水100 mL，115 ℃滅菌20 min；WL營養瓊脂培養基：酵母粉5 g/L，酸水解酪蛋白5 g/L，葡萄糖50 g/L，磷酸二氫鉀0.55 g/L，0.425 g/L，氯化鈣0.125 g/L，硫酸錳0.125 g/L，硫酸鎂0.002 5 g/L，氯化鐵0.002 5 g/L，溴甲酚綠0.022 g/L，瓊脂15 g/L，蒸餾水100 mL，121 ℃滅菌15 min；發酵培養基：無水葡萄糖200 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，蒸餾水100 mL，115 ℃滅菌15 min。

2、儀器與設備

SW-CJ-1FD超凈工作臺、SPX-250B-Z型生化培養箱、YXQ-75S11立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；ZQPL-200立式全溫震蕩培養箱 天津市有限公司；HH-21-6電熱恒溫水浴鍋 上海助藍儀器科技有限公司；BSA124S-CW電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；JXFSTPRP-24細胞破碎儀 上海凈信發展有限公司；NP-30S渦旋混合儀 常州恩培儀器制造商有限公司；LC-LX-H185C臺式高速離心機 上海力辰邦西儀器科技有限公司；S-10生物傳感器分析儀 深圳市西爾曼科技有限公司。

3、方法

（1）菌種活化

將－80 ℃甘油管保藏菌株，劃線于YPD固體平板上，30 ℃恒溫培養48 h后，將平板上單菌落挑取至100 mL滅菌的YPD液體培養基中，30 ℃、120 r/min培養48 h，使得培養基中細胞數達到108 CFU/mL，備于接種。

（2）共同接種發酵

對照組：將Sc和Wa分別接種于發酵培養基中，接種量為5×105 CFU/mL，30 ℃培養至發酵停止，發酵前2 d內每隔4 h取樣，稀釋涂布于WL鑒別培養基中，2 d后每隔24 h涂布一次，觀察過程中生物量變化。

實驗組：1）正常混合發酵：將Sc和Wa以1∶1（都為5×105 CFU/mL）比例接種于發酵培養基中，計數方法與對照組一致；2）不同初始濃度的Wa接種：梯度為5×105、2.5×106、1×107 CFU/mL接種于發酵培養基中，每隔2 d涂布于WL固體平板計數；3）高濃度Sc接種：Sc以107 CFU/mL接種量，Wa以5×105 CFU/mL同時接種于發酵培養基中，計數方法與對照組一致。

以上實驗均在30 ℃下恒溫培養。

（3）酵母細胞對乙醇耐受性

活化好的兩種菌按接種量5×105 CFU/mL接種到100 mL YPD液體培養基（乙醇體積分數分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%接入培養基中）中，30 ℃、120 r/min培養48 h，稀釋涂平板，30 ℃恒溫培養2 d，計算菌落總數。以上實驗組均有3 組平行，取平均值。

（4）發酵上清液制備

制備純Sc發酵、純Wa發酵以及混合發酵上清液，將培養2、4、6 d后的3 個時間段發酵液靜置10 min，分別倒入50 mL已滅菌的離心管，8 000 r/min離心5 min，重復離心2 次，取上清液，再次倒入新的離心管，重復離心步驟，在超凈臺中過0.22 μm濾膜，去除剩余酵母細胞，得到無細胞的發酵上清液備用。

（5）死細胞和破碎細胞處理

參考Nissen等實驗，100 ℃煮沸等量的Sc細胞10 min，得到死Sc細胞，放入100 mL離心管中，8 000 r/min離心5 min，重復離心2 次后備用；將5 000 r/min離心10 min后的細胞沉淀放入冷凍細胞破碎機中破碎5 min，再次重復離心，取出破碎細胞備用。

（6）透析袋實驗

通過Renault等設計的一種新型模型，模仿其設計透析袋發酵罐實驗，選擇1 000 Da和12 kDa截留分子質量的透析袋，發酵罐內加入發酵培養基，將透析袋和發酵罐進行組合。透析袋100 ℃高溫煮沸10 min備用，將煮好的透析袋放入發酵罐中，透析袋內外加入等量的發酵培養基，罐口封上封口膜，115 ℃滅菌20 min，發酵罐透氣測溫頂蓋65 ℃下滅菌30 min取出，經過乙醇消毒后紫外線照射15 min，在超凈臺中組合，接菌后放入30 ℃恒溫培養箱。

接種方式：將Wa接種于透析袋內，Sc接種于透析袋外，為驗證透析袋實驗準確性，作為對照將Sc接種在透析袋內，Wa接種在透析袋外，每4 h測定每組透析袋內外的生物量、葡萄糖、乙醇含量，測定至36 h。接種量均為5×105 CFU/mL。

以上實驗均重復3 次取平均值。

（7）發酵動力學測定

3 組分別為純Sc接種、純Wa接種、Sc與Wa混合接種（1∶1）。其中發酵培養基為20%含糖量的液體YPD培養基，純發酵以及混合發酵接種每種菌體接種量都為5×105 CFU/mL。接種后，每隔1 d稱質量一次，一直到發酵結束為1 個周期，以CO2質量損失測定其發酵速率v，計算如下式所示：

式中：Mn為發酵第n天總質量損失；Mn－1為發酵第n－1天總質量損失。

（8）葡萄糖和乙醇測定

緩沖液準備：將緩沖液粉倒入緩沖液瓶，加入5 000 mL純水充分溶解6 h后使用（必須一次性配完5 000 mL，不能拆分配制，否則會損壞酶膜）。

生物傳感器測定：進行葡萄糖與乙醇標定，每次使用前，將葡萄糖（1 g/L）和乙醇（0.5 g/L）標準液從4 ℃取出，系統調至定標操作，將25 μL標準液注入感應器中，調整電極電量，定標3 次至系統顯示通過，每測定10 次樣品后需重新定標進樣（乙醇量程0～1 g/L、葡萄糖量程0～2 g/L），樣品條件：稀釋倍數使得葡萄糖與乙醇都在量程范圍內才能測定。

樣品測定：將發酵培養基中的溶液混勻，在無菌超凈臺中取樣，首先取1 mL樣品放入離心管，2 000 r/min離心5 min，吸取離心清液中不同部分（上、中、下）溶液各100 μL，稀釋于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容（稀釋100 倍），再用標準溶液標定生物傳感器，使得系統標定成功。測定時加入25 μL的樣品稀釋液，測定樣品葡萄糖和乙醇含量，均測定3 次取平均值。

（9）生物量測定

平板計數法：在混合培養條件下，由于Sc和Wa在電子顯微鏡下生長形態相似，肉眼難以區分，有研究發現，WL選擇培養基能分辨不同的酵母菌，通過預實驗發現Sc在WL鑒別培養基中呈現黃色凸起狀，而Wa在WL鑒別培養基中呈現白色扁平狀，故可以采用WL鑒別培養基進行計數。

血球計數板法：添加亞甲基藍溶液對酵母活細胞進行染色再計數。

4、數據處理

利用OrginPro 2018C軟件對數據進行作圖分析、利用Adobe illustrator CS6進行優化作圖和組合。

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