子宮內(nèi)膜著床失敗是不育的重要原因，但目前對于其背后的機制尚不明確，主要是缺乏能夠構(gòu)建有組織的子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)并在體外重現(xiàn)著床過程的技術(shù)。

盡管已經(jīng)有了子宮內(nèi)膜類器官，但它們僅由上皮細胞構(gòu)成，且其頂端面向內(nèi)部，阻礙了胚泡附著。此外，這些類器官被嵌入在細胞外基質(zhì)（ECM）中，這可能阻礙胚泡與上皮細胞的直接接觸。

(一)構(gòu)建頂端向外的小鼠子宮內(nèi)膜類器官的詳細步驟

步驟

操作內(nèi)容

培養(yǎng)條件

預(yù)期結(jié)果

1

小鼠子宮組織分離

- 使用膠原酶和DNase I在無Ca2?/Mg2?的PBS中消化30分鐘，37°C水浴，100bpm搖晃

- 用冰冷PBS稀釋至15ml，收集上皮細胞分數(shù)

獲得子宮內(nèi)膜上皮細胞（EECs）和基質(zhì)細胞（ESCs）的分離物

2

細胞培養(yǎng)

- 將分離的細胞重新懸浮在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并離心兩次

- 將上皮細胞分數(shù)與基質(zhì)細胞分數(shù)混合，接種到12孔培養(yǎng)板中，每孔1ml擴增培養(yǎng)基（不涂任何涂層）

- 37°C，5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第1、3、5天更換培養(yǎng)基

細胞開始在培養(yǎng)板邊緣向中心自然聚集，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)

3

聚集體的收集與再接種

- 第3天，用1000μl移液管收集環(huán)狀聚集體到1.5ml管中，通過剪短的200μl移液管吹打分散成小聚集體

- 將小聚集體重新接種到同一培養(yǎng)皿中

EECs傾向于位于外圍，ESCs占據(jù)內(nèi)部

4

轉(zhuǎn)移到低黏附培養(yǎng)皿

- 第7天，將每個聚集體分別挑出，并在96孔低黏附U型底培養(yǎng)皿中用擴張培養(yǎng)基培養(yǎng)

- 每兩天更換一次培養(yǎng)基

經(jīng)過3天懸浮培養(yǎng)（第10天），類器官形成

5

懸浮培養(yǎng)以促進類器官形成

懸浮培養(yǎng)過程中，覆蓋外表面的透明層逐漸增厚，最終包裹整個聚集體

類器官外層由EECs組成，內(nèi)層由ESCs填充，形成頂端向外的結(jié)構(gòu)

6

激素處理以誘導(dǎo)接受狀態(tài)

使用雌二醇（E2）、cAMP和醋酸甲地孕酮（MPA）處理類器官48小時

類器官對激素有響應(yīng)，可模擬體內(nèi)子宮內(nèi)膜的接受狀態(tài)

7

與胚泡共培養(yǎng)

將處理后的類器官與從GFP轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的胚泡在低黏附U型底培養(yǎng)皿中共培養(yǎng)

觀察胚泡附著、上皮內(nèi)陷、吞噬作用和侵入等著床過程

（二）頂端向外的細胞排布是如何實現(xiàn)的？

2.1 利用細胞的自組織特性

- 細胞初始聚集：將子宮內(nèi)膜上皮細胞（EECs）和基質(zhì)細胞（ESCs）同時接種到黏附培養(yǎng)板中，在特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。從第2天開始，細胞會自發(fā)聚集，到第3天形成大型環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這種聚集現(xiàn)象是細胞自組織的初步表現(xiàn)，可能與細胞間的黏附特性有關(guān)。

- 細胞類型特異性重排：在第5天，細胞聚集體內(nèi)部發(fā)生了顯著的細胞類型特異性重排，EECs傾向于位于聚集體的外圍，而ESCs則占據(jù)內(nèi)部。這種重排是細胞依據(jù)自身特性進行的自我組織過程，可能涉及細胞間的相互識別和信號傳遞。

2.2 懸浮培養(yǎng)促進細胞極性形成

- 透明層的形成與細胞形態(tài)變化：將細胞聚集體轉(zhuǎn)移到低黏附U型底培養(yǎng)皿中進行懸浮培養(yǎng)。在懸浮培養(yǎng)的前3天，覆蓋聚集體外表面的透明層逐漸增厚并最終包裹整個聚集體。這個透明層是由E-鈣黏蛋白陽性的EECs組成的上皮細胞層。同時，扁平的EECs逐漸變成柱狀細胞，細胞高度增加，這表明細胞在懸浮培養(yǎng)過程中發(fā)生了形態(tài)變化，以適應(yīng)三維環(huán)境并形成頂端向外的結(jié)構(gòu)。

- 細胞表面結(jié)構(gòu)的形成：掃描電子顯微鏡（SEM）觀察顯示，懸浮培養(yǎng)后類器官的整個表面都被光滑的EECs覆蓋，沒有ESCs暴露在外。此外，類器官表面觀察到了微絨毛等頂端結(jié)構(gòu)特征，還發(fā)現(xiàn)了類似pinopodes的大型圓頂狀突起，這些結(jié)構(gòu)在體內(nèi)子宮內(nèi)膜的腔面上皮細胞中也有表達，進一步證實了EECs的頂端向外取向。

2.3 培養(yǎng)基成分的引導(dǎo)作用

- 特定培養(yǎng)基的使用：在整個培養(yǎng)過程中，使用了專門為子宮內(nèi)膜類器官培養(yǎng)設(shè)計的擴增培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基含有多種成分，如B27、N2、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（ITS）、尼克酸胺、表皮生長因子（EGF）、成纖維細胞生長因子-基礎(chǔ)（FGF-Basic）、Noggin、TGFβ/Alk抑制劑A83-01、R-spondin、WNT3A等，這些成分共同作用，為細胞的生長、分化和極性形成提供了必要的信號和營養(yǎng)支持，引導(dǎo)細胞形成頂端向外的結(jié)構(gòu)。

2.4 培養(yǎng)步驟的協(xié)同作用

- 黏附培養(yǎng)與懸浮培養(yǎng)的結(jié)合：先在普通培養(yǎng)皿中進行黏附培養(yǎng)，使細胞能夠初步聚集并形成一定的組織結(jié)構(gòu)，然后通過分散和重新接種，再轉(zhuǎn)移到低黏附培養(yǎng)皿中進行懸浮培養(yǎng)。這種培養(yǎng)方式的轉(zhuǎn)變對于細胞的自組織和類器官的成熟至關(guān)重要，黏附培養(yǎng)為細胞提供了初始的相互作用和組織形成的平臺，而懸浮培養(yǎng)則為細胞的進一步分化和極性形成提供了三維的空間環(huán)境，使EECs能夠在外圍形成頂端向外的結(jié)構(gòu)，而ESCs則填充內(nèi)部。

（三）本文的創(chuàng)新點

3.1 類器官結(jié)構(gòu)設(shè)計的創(chuàng)新

- 頂端向外的細胞排布：傳統(tǒng)子宮內(nèi)膜類器官存在基底向外、頂端向內(nèi)的極性，導(dǎo)致胚泡無法在體外附著到上皮細胞的頂端表面。而原文作者研究開發(fā)的類器官實現(xiàn)了頂端向外的結(jié)構(gòu)，使E-鈣黏蛋白陽性的上皮細胞位于外部，波形蛋白陽性的基質(zhì)細胞位于內(nèi)部，成功模擬了體內(nèi)子宮內(nèi)膜的細胞排布，為胚泡附著提供了合適的界面。

- 無需嵌入細胞外基質(zhì)（ECM）：以往的類器官通常需要嵌入ECM如Matrigel中進行培養(yǎng)，這阻礙了胚泡與上皮細胞的直接接觸。原文作者研究的類器官無需ECM嵌入，使上皮細胞暴露，有利于胚泡與上皮細胞的直接相互作用，更真實地模擬體內(nèi)環(huán)境。

3.2 著床過程模擬的創(chuàng)新

- 完整著床過程的重現(xiàn)：在體外成功重現(xiàn)了小鼠胚泡著床的全過程，包括胚泡附著、上皮內(nèi)陷、細胞吞噬（entosis）和胚泡侵入四個步驟。通過時間序列成像技術(shù)，實時觀察到了這些動態(tài)過程，為研究著床機制提供了直觀的證據(jù)。

- 著床反應(yīng)的準確模擬：侵入類器官的胚泡衍生細胞表現(xiàn)出類似于滋養(yǎng)層巨細胞的形態(tài)和增殖蛋白陽性特征，同時周圍的基質(zhì)細胞表達了蛻膜化標記物環(huán)氧化酶2，這表明類器官能夠準確模擬體內(nèi)著床過程中的滋養(yǎng)層細胞分化和基質(zhì)細胞蛻膜化反應(yīng)。

3.3 類器官形成方法的創(chuàng)新

- 基于細胞自組織的形成機制：利用子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞在黏附培養(yǎng)條件下的自發(fā)聚集能力，結(jié)合后續(xù)的懸浮培養(yǎng)，實現(xiàn)了類器官的自組織形成。這種形成機制不需要外力干預(yù)，依靠細胞自身的特性和相互作用，形成了具有特定空間結(jié)構(gòu)的類器官。

- 的培養(yǎng)流程：先將細胞在普通培養(yǎng)皿中進行黏附培養(yǎng)，誘導(dǎo)細胞自發(fā)聚集形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，再經(jīng)過分散和重新接種，最后轉(zhuǎn)移至低黏附培養(yǎng)皿中進行懸浮培養(yǎng)，逐步形成類器官。這一的培養(yǎng)流程有助于細胞的自組織和類器官的成熟。

3.4 激素響應(yīng)性的創(chuàng)新

類器官對激素處理有明顯的響應(yīng)，能夠通過調(diào)節(jié)激素水平誘導(dǎo)類器官進入胚泡接受狀態(tài)，顯著提高了胚泡的附著和侵入效率。這種激素響應(yīng)性對于研究著床過程中的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機制具有重要意義，也為未來開發(fā)激素治療策略提供了實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

3.5 對比先前模型的創(chuàng)新

- 克服傳統(tǒng)模型局限性：解決了傳統(tǒng)二維和三維共培養(yǎng)模型在重建子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和模擬著床過程方面的不足，如無法準確模擬子宮內(nèi)膜的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和細胞間相互作用等。

- 綜合解決多個問題：雖然此前有研究分別解決了類器官的一些局限性，但本研究同時克服了所有關(guān)鍵問題，包括細胞極性、基質(zhì)細胞的缺失以及ECM的阻礙等，使類器官在模擬體內(nèi)環(huán)境和著床過程方面更加完善。

(四) 技 術(shù) 展 望

將頂端向外的小鼠子宮內(nèi)膜類器官與Kirkstall Quasi Vivo類器官動態(tài)灌流培養(yǎng)系統(tǒng)相結(jié)合：

4.1 提升類器官的生理功能模擬

- 更真實的營養(yǎng)物質(zhì)交換：Quasi Vivo系統(tǒng)通過動態(tài)灌流模擬體內(nèi)血管系統(tǒng)，為類器官提供精準的營養(yǎng)物質(zhì)輸送和代謝廢物清除。與傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)相比，這種動態(tài)環(huán)境能更真實地模擬體內(nèi)子宮內(nèi)膜的營養(yǎng)物質(zhì)交換過程，使類器官的代謝和功能更接近體內(nèi)真實狀態(tài)。

- 增強細胞間和細胞-基質(zhì)間相互作用：動態(tài)灌流產(chǎn)生的流體剪切力可以促進細胞間的信號傳遞和相互作用，模擬體內(nèi)復(fù)雜的生物力學(xué)環(huán)境。同時，系統(tǒng)提供的三維培養(yǎng)支持結(jié)構(gòu)有助于類器官維持更好的形態(tài)和細胞外基質(zhì)的形成，從而增強細胞與基質(zhì)之間的相互作用，進一步提升類器官的生理功能模擬。

4.2 改善類器官的長期培養(yǎng)與穩(wěn)定性

- 延長類器官活性：在靜態(tài)培養(yǎng)條件下，類器官在長時間培養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)營養(yǎng)不良、代謝產(chǎn)物積累等問題，導(dǎo)致細胞活力下降和組織結(jié)構(gòu)破壞。而Quasi Vivo系統(tǒng)的動態(tài)灌流能夠持續(xù)提供新鮮的培養(yǎng)基，及時清除代謝廢物，有助于維持類器官的長期活性和穩(wěn)定性，延長其可使用時間。

- 促進類器官的成熟與分化：動態(tài)培養(yǎng)環(huán)境為類器官的成熟和分化提供了更理想的條件。細胞在持續(xù)的營養(yǎng)供應(yīng)和適宜的生物力學(xué)刺激下，能夠更好地完成其正常的生理功能和分化過程，使類器官的組織結(jié)構(gòu)和功能更加完善，從而更準確地模擬體內(nèi)子宮內(nèi)膜的生理狀態(tài)。

4.3 增強類器官與胚泡相互作用的準確性

- 更精準的激素調(diào)節(jié)：Quasi Vivo系統(tǒng)可以精確控制培養(yǎng)環(huán)境中的激素濃度和動態(tài)變化，模擬體內(nèi)復(fù)雜的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)過程。在研究胚泡著床過程中，通過動態(tài)調(diào)節(jié)激素水平，可以更精確地研究不同激素對胚泡與類器官相互作用的影響，深入了解著床過程中的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機制。

- 更真實的機械力環(huán)境：系統(tǒng)模擬的體內(nèi)流體環(huán)境所產(chǎn)生的機械力，如剪切力等，可以影響細胞的黏附、遷移和分化等過程。在胚泡與類器官相互作用中，這些機械力可能對胚泡的附著和侵入等步驟產(chǎn)生重要影響。通過結(jié)合Quasi Vivo系統(tǒng)，可以更好地研究機械力在著床過程中的作用，為揭示其背后的分子機制提供新的視角。

4.4 推動疾病模型研究與藥物篩選

- 更準確的疾病模型模擬：在研究子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病（如子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜癌等）時，結(jié)合Quasi Vivo系統(tǒng)的頂端向外小鼠子宮內(nèi)膜類器官可以更準確地模擬疾病發(fā)生發(fā)展的微環(huán)境。動態(tài)灌流培養(yǎng)能夠反映疾病狀態(tài)下復(fù)雜的生理病理變化，為研究疾病的發(fā)病機制提供更可靠的模型。

- 高通量藥物篩選平臺的構(gòu)建：Quasi Vivo系統(tǒng)具有良好的擴展性和可重復(fù)性，通過將多個類器官培養(yǎng)模塊連接在一起，可以構(gòu)建高通量藥物篩選平臺。在這種平臺上，可以同時測試多種藥物對子宮內(nèi)膜類器官的影響，快速篩選出具有潛在治療效果的藥物，為開發(fā)新的治療策略提供有力支持。

公司主營產(chǎn)品：

Kilby 3D-clinostat 旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)儀，

Kilby Gravite微/超重力三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，

3D回轉(zhuǎn)重力環(huán)境模擬系統(tǒng)，隨機定位儀，

類器官芯片搖擺灌注儀，

Kirkstall 類器官串聯(lián)芯片灌流仿生構(gòu)建系統(tǒng)