胞漿異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）活性檢測試劑盒（微量法）

產(chǎn)品貨號：BA1050

產(chǎn)品規(guī)格：100管/96樣

產(chǎn)品說明：

ICDHc（EC 1.1.1.42）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，催化異檸檬酸脫氫脫羧生成α-酮戊二酸，同時還原NADP+生成NADPH。ICDHc是細胞質(zhì)中除了磷酸戊糖途徑外又一種NADPH重要來源，在逆境中該酶活性通常會發(fā)生顯著變化。

利用ICDHc催化NADP+還原成NADPH反應(yīng)，在340nm下測定NADPH濃度的增加，即可反映ICDHc活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

產(chǎn)品內(nèi)容：

溶液的配制：

1. 試劑一：用時加入20mL提取液溶解；

2. 試劑二：用時每支加275μL雙蒸水充分溶解備用；

3. 試劑三：用時每支加275μL雙蒸水充分溶解備用；

4. 工作液配制：將試劑一、試劑二、試劑三按85：1：1的比例混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。

 所需的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研缽/勻漿器、 冰和蒸餾水。

測定步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 細菌、細胞或組織樣本的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每200萬細菌或細胞加入400μL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。     

組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 血清（漿）樣本：直接檢測。

二、測定步驟 

1. 分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 按下表步驟加樣：

將上述試劑按順序加入微量石英比色皿/石英96孔板中，加樣本的同時開始計時，在340nm波長下記錄20秒時的初始吸光度A1；迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入37℃水浴中，準確反應(yīng)2分鐘（酶標儀有控溫功能，可以將溫度調(diào)至37℃）；迅速取出比色皿并擦干，記錄2分20秒時的吸光度A2。計算ΔA=A2-A1。）

三、ICDHc活力單位的計算

a、按微量石英比色皿計算：

1. 血清（漿）ICDHc活力的計算

單位的定義：每mL血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

ICDHc（U/mL）=[ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷V樣本÷T=1608×ΔA

2. 組織中ICDHc活力的計算

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

ICDHc（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(V樣本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算：

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

ICDHc（U/g質(zhì)量）=[ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(W÷V提取×V樣本) ÷T=1608×ΔA÷W

3. 細菌或培養(yǎng)細胞中ICDHc活力的計算

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

ICDHc（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(V樣本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

ICDHc（U/10⁴ Cell）=[ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(V樣本×500)÷T=3.2×ΔA

V反總：反應(yīng)總體積，2×10^-4L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/moL/cm；d：石英比色皿光徑，1cm； V樣本：加入樣本體積，0.01mL；V提取：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量， g；T：反應(yīng)時間，2min；500：細菌或細胞密度，500萬/mL。

b、按96孔板（UV板）計算：

將上述公式中光徑d-1cm改為d-0.6cm（96孔板光徑）進行計算即可。

注意事項：

1. 若A2-A1大于0.5，需將酶液用提取液稀釋，使A2-A1小于0.5，可提高檢測靈敏度。若初始值A1大于0.5可嘗試將酶液用提取液稀釋。

2. 實驗時，試劑二、試劑三和樣本在冰上放置，以免變性和失活；工作液37℃水浴放置。

3. 比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃，取小燒杯一只裝入一定量的 37℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。

4. 兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結(jié)果的準確性。