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脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的原理和操作步驟

來源:上海聯(lián)碩生物科技有限公司   2025年05月09日 14:43  

一般來說細胞轉(zhuǎn)染的方法主要包括:電穿孔法、顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、多種陽離子物質(zhì)介導、病毒介導的轉(zhuǎn)染等。

01

脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染方法原理

脂質(zhì)體作為體內(nèi)和體外輸送載體的工具,已經(jīng)研究的十分廣泛,用合成的陽離子脂類包裹 DNA,同樣可以通過融合而進入細胞。

使用脂質(zhì)體將 DNA 帶入不同類型的真核細胞,與其它方法相比,有較高的效率和較好的重復性。

中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹 DNA,借助脂質(zhì)膜將 DNA 導入細胞膜內(nèi)。

帶正電的陽離子脂質(zhì)體,DNA 并沒有預先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負電的 DNA 自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成 DNA-陽離子脂質(zhì)體復合物,從而吸附到帶負電的細胞膜表面,經(jīng)過內(nèi)吞被導入細胞。

02

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的操作步驟

操作步驟:

(1) 細胞培養(yǎng):取 6 孔培養(yǎng)板 (或用 35 mm 培養(yǎng)皿),向每孔中加入 2 mL 含 1~2×105 個細胞培養(yǎng)液,37℃ CO2 培養(yǎng)至 40%~60% 匯合時 (匯合過分,轉(zhuǎn)染后不利篩選細胞)。

(2) 轉(zhuǎn)染液制備:在聚苯乙/烯管中制備以下兩液 (為轉(zhuǎn)染每一個孔細胞所用的量)A 液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋 1-10 μg DNA,終量 100μL,B 液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋 2-50 μgLR,終量 100μL,輕輕混合 A、B 液,室溫中置 10-15 分鐘,稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象,但并不妨礙轉(zhuǎn)染 (如出現(xiàn)沉淀可能因 LR 或 DNA 濃度過高所致,應(yīng)酌情減量)。

(3) 轉(zhuǎn)染準備:用 2 mL 不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次,再加入 1 mL 不含血清培養(yǎng)液。

(4) 轉(zhuǎn)染:把 A/B 復合物緩緩加入培養(yǎng)液中,搖勻,37℃ 溫箱置 6~24 小時,吸除無血清轉(zhuǎn)染液,換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

(5) 其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉(zhuǎn)染法相同。

注意:轉(zhuǎn)染時切勿加血清,血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響。


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