本文要點：通過檢測染料標記的白蛋白，可在體內滲入腦實質來可視化血腦屏障（BBB）破壞。盡管伊文思藍（EB）和吲哚菁綠（ICG）染料已被用于評估BBB損傷，但它們的可見光或近紅外一區（NIR-I）成像窗口，限制了這種 “白蛋白基礎”策略的成像靈敏度和對比度。在此，本文構建了一種針對白蛋白的近紅外二區（NIR-II）特異性標記探針，作為發色團用于在中風中構建熒光蛋白以評估BBB破壞。經過優化的發色團C7-1080可以通過親核取代與白蛋白共價結合，無需佐劑即可形成熒光蛋白。同時白蛋白通過緊密的夾持效應，有效增強發色團的亮度并增強其穩定性。通過理論模擬、蛋白質組學和蛋白質突變技術研究白蛋白與發色團之間的結合行為。原位NIR-II熒光蛋白構建策略聯合IR-808Ac探針，有助于在缺血性中風期間對BBB破壞和腦血管實現高精度雙通道成像。總體而言，這種原位白蛋白特異性標記為診斷和監測中風提供了新工具，有望用于研究相關疾病的進展和治療反應。

熒光蛋白，活體熒光成像技術

在本文中，研究者應用分子側基工程策略進一步優化染料結構，使其具有選擇性的白蛋白標記特性。體外結果證實，作為發色團的NIR-II白蛋白靶向染料（C7-1080）能夠在室溫或生理溫度下，無需任何催化劑，與人血清白蛋白（HSA）疏水腔中的半胱氨酸發生親核取代反應，完成位點特異性共價結合，從而形成NIR-II FPs。值得注意的是，作為外殼的HSA通過緊密夾持效應增強了發色團的亮度和光穩定性。更重要的是，由染料與可靠的白蛋白相互作用原位生成的NIR-II FPs為中風中血腦屏障（BBB）破壞的精確定位提供了可能（方案1）。這項工作從仿生的角度為原位NIR-II FPs的構建提供了概念驗證，有望為中風相關疾病的研究提供一種強大的技術工具。

圖1. 篩選和表征具有最佳NIR-II亮度的Cn-1080染料

根據研究者之前對染料結構與外源性白蛋白結合能力的研究，選擇了1080染料骨架結構作為構建原位NIR-II FPs的發色團候選（圖1a）。隨后，利用分子側基工程策略對Cn-1080染料的結構進行了優化，以篩選出具有優異光學性能和高效白蛋白標記性能的NIR-II發色團。如圖1b-d所示，NIR-II亮度、紫外吸收和熒光數據一致表明，羧基側鏈的長度直接影響了Cn-1080染料的光學性能。C7-1080染料分子展現了更優的NIR-II亮度和光穩定性，遠超臨床批準的ICG探針（圖1e）。

研究者利用分子動力學方法模擬了不同Cn-1080染料的最佳構象，并對其分子振動進行了定量分析。如圖1f所示，不同Cn-1080染料的側鏈呈現出不同的最佳構象，兩個羧基傾向于“手拉手”形成分子內氫鍵以限制分子振蕩。特別是，側鏈長度最為合適的C7-1080染料分子能夠最小化端基擺動，減少扭轉分子內電荷轉移（TICT）的發生，從而展現出更為出色的發光能力（圖1g-i）。同時，研究者還利用密度泛函理論計算了不同Cn-1080染料的最高占據分子軌道（HOMO）和蕞低未占據分子軌道（LUMO）（圖1j）。高斯計算結果顯示，側鏈長度幾乎不影響Cn-1080染料的帶隙，因此相應的峰值沒有明顯的藍移或紅移。上述結果有效證實了Cn-1080染料的發光調節機制源于羧基側鏈對分子骨架扭轉的有效限制。綜上所述，C7-1080染料有望成為構建熒光蛋白的NIR-II發色團候選。

本文進一步詳細研究了Cn-1080染料在體內的白蛋白標記行為。如圖2所示，血管造影和體內代謝成像表明，與其它Cn-1080系列染料相比，尾靜脈注射后，C7-1080染料展現出更顯著的熒光信號和信噪比。同時代謝數據也證實，Cn-1080系列染料具有優異的體內排泄能力，在尾靜脈注射72小時后幾乎無熒光信號殘留。

為了深入了解體內成像差異的原因，研究者進一步分析了Cn-1080與全血（WB）以及小鼠血清（MS）的結合行為（圖2b）。WB@Cn-1080和MS@Cn-1080復合物的NIR-II亮度和凝膠電泳數據均表明，C7-1080在體內展現出最佳的白蛋白熒光標記能力。此外，如圖2g所示，對注射C7-1080染料的小鼠全血進行離心分析發現，C7-1080染料優先與血清中的白蛋白共價結合，而非血漿，從而在原位形成NIR-II熒光蛋白（圖2h,i）。總體而言，這些研究表明C7-1080可作為白蛋白的熒光標記物，用于原位構建熒光蛋白。

圖3. 使用原位白蛋白標記染料對血腦屏障（BBB）破壞進行靶向成像

血腦屏障（BBB）的特點是血液與腦實質之間具有高度選擇性通透性。正常情況下，白蛋白在腦組織中很少見。然而，在中風或創傷事件后，血液可通過受損的BBB滲入腦實質，導致局部白蛋白水平急劇上升。因此，開發能與內源性白蛋白特異性原位結合的NIR-II探針，有望為監測BBB破壞提供更好的成像工具。

得益于C7-1080染料與白蛋白之間可靠的相互作用，本文不僅能夠直接觀察白蛋白的泄漏，還有望在中風期間精確定位BBB的破壞部位。如圖3a所示，研究者成功建立了光栓塞中風（PTS）模型，位于小鼠左側大腦皮層的梗死區域。如圖3b-d所示，先從尾靜脈注射C7-1080染料，驗證NIR-II FPs在體內的形成及藥代動力學特征。血液亮度、凝膠電泳和蛋白染色有效證實了熒光蛋白在體內的形成，并具有持續的體內循環時間，為靶向成像BBB破壞奠定了基礎。如圖3e,f所示，與假手術組相比，熒光信號在中風區域逐漸累積，早在10分鐘就檢測到泄漏，表明其通過受損的BBB滲入腦實質。相比之下，由于白蛋白逃逸的NIR探針（IR-808Ac）與白蛋白無共價結合，其在體內的快速肝清除和短循環時間導致其無法對中風中的BBB破壞進行成像。此外，研究者通過調節光栓塞時間建立不同程度的中風模型，以評估C7-1080染料監測BBB破壞的靈敏度。令人鼓舞的是，即使在光栓塞時間為1分鐘的輕度癥狀中風模型中，C7-1080染料仍展現出良好的BBB破壞檢測效果。如圖3g,h所示，TTC和EB染色區域與NIR-II熒光成像區域基本一致。這些結果表明，基于PTS方法的腦缺血中風會導致BBB損傷/破壞，使血漿成分滲入腦實質。上述現象有效表明，C7-1080染料突出的原位白蛋白標記能力是其實現對BBB破壞敏感和特異性成像的直接原因。

為了更深入地了解BBB損傷區域周圍血液路徑的變化，選擇了另一種白蛋白逃逸的NIR探針（IR-808Ac），其在808 nm處具有最佳激發性，用于中風小鼠的腦血管可視化。研究者隨后分別在兩個不同的成像通道下捕獲了BBB泄漏（1064 nm激發，C7-1080）和腦血管系統動態變化（808 nm激發，IR-808Ac）的NIR-II圖像。結果顯示，IR-808Ac不僅能夠清晰、動態地描繪出缺血性中風期間血流路徑的變化和恢復，還能實時區分動靜脈血管。值得注意的是，雙通道成像顯示，在BBB損傷區域幾乎未見血管被照亮。中風后的實時血管造影顯示，損傷部位附近的血供暫時喪失，隨后恢復，缺血區域隨著時間的推移逐漸形成損傷區域。同時，雙通道成像也有效地表明，缺血性中風成像的本質是通過標記白蛋白流經BBB破壞區域，從血管滲入腦實質。

基于分子側鏈工程策略，本文提出了一類具有亮近紅外二區（NIR-II）發光和白蛋白特異性共價標記能力的染料分子（Cn-1080），作為原位構建熒光蛋白的NIR-II發色團。體外和體內實驗表明，C7-1080發色團無需額外輔助即可與白蛋白（如人血清白蛋白HSA）通過親核取代反應實現位點特異性共價結合，原位形成NIR-II熒光蛋白。特別是作為熒光蛋白外殼的HSA，通過緊密夾持效應，增強了發色團的亮度并調節了其穩定性。發色團與白蛋白的相互作用產生的原位NIR-II熒光蛋白，不僅可以直觀地顯示白蛋白的泄漏，還能高精度地對缺血性中風中的血腦屏障（BBB）破壞進行成像。通過與白蛋白逃逸探針IR-800Ac的有效結合，還實現了BBB破壞和腦血管的實時雙通道成像，為理解缺血性中風的機制提供了新的視角。總體而言，這種原位熒光蛋白構建策略有望彌補當前NIR-II熒光蛋白的局限性，并為中風相關疾病的研究帶來新的機遇。

參考文獻

Xu J, Du Y, Zhu N, et al. NIR-II Fluorescent Protein Created by In Situ Albumin-Tagging for Sensitive and Specific Imaging of Blood-Brain Barrier Disruption[J]. Advanced sScience, 2025.

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