植物堿性焦磷酸酶（Alkaline Pyrophosphatase）活性比色法法定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

 植物堿性焦磷酸酶（Alkaline Pyrophosphatase）活性比色法法定量檢測試劑是一種旨在使用無機焦磷酸，在堿性焦磷酸酶去磷酸化后，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產生鉬藍顯色反應后峰值的變化，采用比色法測定其峰值的變化，以此進行測算單位酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種植物組織，包括種子、球莖（bulb）、塊莖（tuber）、根（root）、種葉（coleoptile）和葉片裂解懸液樣品或純化以及粗提的酶蛋白的堿性焦磷酸酶活性及其抑制劑的檢測。 產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

技術背景

焦磷酸酶（Pyrophosphatase；PPase；；EC3.6.1.1），又稱為無機焦磷酸酶（ inorganic pyrophosphatase），屬于磷酸酶家族，包括磷酸單酯酶（phosphomonoesterase）、磷酸二酯酶（phosphodiesterase）等。通過釋放磷酸根，參與DNA合成、RNA合成、輔酶合成、鈣吸收、骨形成、氨基酸合成和脂肪酸代謝的激活等代謝活動。焦磷酸酶分為堿性和酸性，前者作用于合成代謝，而后者作用于分解反應。焦磷酸酶催化無機焦磷酸水解產生2個磷酸根離子的反應，為能量釋放反應（exergonic reaction）。在植物中，尤其碳4或碳3植物的葉片中，活性最高。在固碳還原和光合作用起著重要作用成為碳4植物通路的指標。基于底物無機焦磷酸，在堿性條件下，受到堿性焦磷酸酶的去磷酸化作用，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產生鉬藍顯色反應后，在分光光度儀下（660nm波長）產生峰值的變化，由此測定堿性焦磷酸酶的活性。

產品內容

 清理液（Reagent A）         毫升

 裂解液（Reagent B）         毫升

 緩沖液（Reagent C）         毫升

 陰性液（Reagent D）         毫升

 反應液（Reagent E）         微升

 顯色液（Reagent F）         毫升

 標準液（Reagent G）         微升

產品說明書             1份

保存方式

保存  裂解液（Reagent B）和  顯色液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；  顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸； 有效保證3月

用戶自備

15毫升離心管：用于樣品處理的容器

1.5毫升離心管：用于樣品處理和保存的容器

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織樣品

（微型）臺式離心機：用于樣品收集

培養箱：用于孵育反應物

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、 樣品準備

1． 準備好新鮮的植物組織，并秤重以確定組織重量200毫克

1． （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管

2． （選擇步驟）加入xx毫升  清理液（Reagent A）清洗1次

3． 移入到一個液氮凍存管

4． 即刻放進液氮罐過夜

5． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）

6． 放進一個15毫升錐形離心管

7． 加入預冷的xx微升  裂解液（Reagent B）

8． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

9． 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器

10． 在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）

11． 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管

12． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

13． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

14． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

15． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、測定準備

1． 準備好待測樣品（例如植物裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：樣品須澄清）

2． 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為660nm，并置零  

3． 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管

4． 按下表分別加入  陰性液（Reagent D）和  標準液（Reagent G）到每個離心管，混勻

5． 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

三、 標準曲線測定

1． 移取200微升上述配制的標準液到新的比色皿

2． 在30℃溫度下孵育20分鐘

3． 加入xx微升  顯色液（Reagent F），混勻

4． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

5． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數

6． 重復實驗步驟1至6四次

7． 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標（X軸）為標準磷濃度（微摩爾/升）

四、 樣品背景測定

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升待測樣品（總量100微克植物裂解萃取液蛋白）

3． 在30℃溫度下孵育10分鐘

4． 加入xx微升  陰性液（Reagent D），混勻

5． 加入xx微升  顯色液（Reagent F），混勻

6． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

7． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數

8． 根據標準曲線獲得樣品背景對應磷濃度（微摩爾/升）

五、 樣品活性測定

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升待測樣品（總量100微克植物裂解萃取液蛋白）

3． 在30℃溫度下孵育2分鐘

4． 加入xx微升  反應液（Reagent E）

5． 在30℃溫度下孵育10分鐘

6． 加入xx微升  陰性液（Reagent D），混勻

7． 加入xx微升  顯色液（Reagent F），混勻

8． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

9． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數

10． 根據標準曲線獲得樣品總活性對應磷濃度（微摩爾/升）

六、 計算樣品活性

注意事項

1． 本產品為25次操作，包括5次（點）標準測定

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，標準曲線測定只需1條

4． 樣品背景讀數大于1.0，建議稀釋樣品至0.5-1.0之間

5． 如果加樣精準，樣品背景讀數可以跳過

6．  顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸

7． 樣品切忌使用磷酸緩沖液處理

8． 比色測定后，比色皿須清洗

9． 建議使用比色皿測定

10． 如果使用96孔板測定，建議反應孵育時，置于平式搖蕩儀搖蕩孵育，速度為50RPMcedi

11． 如果用戶沒有660nm波長，可以使用600至660nm的任一波長替代

12． 吸光讀數增高，表明具有酶活性

13． 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量； （本公司提供   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

14． 堿性焦磷酸酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 8.9的情況下，每單位酶在單位時間內（每分鐘）釋放1微摩爾的磷

15． 本公司提供系列磷酸酶檢測試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

本產品經鑒定檢測準確