活體細胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位紅色熒光（TMRE）測定試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

主要用途

 活體細胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位紅色熒光（TMRE）測定試劑是一種旨在通過四甲基羅丹明乙酯染料，選擇性地聚集在活性線粒體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色，其熒光的增強或減弱說明線粒體膜電位的變化，即內(nèi)膜電負性的增高或降低，來分析線粒體內(nèi)膜功能的完整性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種線粒體制備物的功能檢測。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰老等的研究。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡易，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

四甲基羅丹明乙酯（tetramethylrhodamin  e ethyl ester；TMRE），為羅丹明衍生物陽離子染料，作為電勢測定（potentiometric）熒光探針：*具有親脂性和可逆性，且細胞低毒和光穩(wěn)定； 第二，與線粒體內(nèi)膜負電極結(jié)合而聚集；第三，容易進入細胞及其線粒體。四甲基羅丹明乙酯進入細胞后，被細胞內(nèi)酯酶切離，產(chǎn)生四甲基羅丹明。四甲基羅丹明進入線粒體后，被線粒體俘獲，分布和結(jié)合在線粒體內(nèi)膜上，呈現(xiàn)強烈熒光。線粒體膜電位的高低變化決定了TMRE的分布濃度。電位高，TMRE在線粒體的濃度高，顯示為強力紅色或桔紅色；反之，TMRE彌散在胞漿內(nèi)，熒光減弱表明線粒體膜電位受到損害。 與TMRM染料相比，較為疏水或親脂性。

產(chǎn)品內(nèi)容

 染色液（Reagent A）    100微升

 稀釋液（Reagent B）     10毫升

 清理液（Reagent C）     50毫升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存 清理液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里； 染色液（Reagent A）避免光照；有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細胞脫離

*細胞培養(yǎng)液（GMS12052）：用于細胞脫落收集

1.5毫升離心管：用于活體細胞線粒體染色的容器

微型臺式離心機：用于細胞收集的操作

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于活體細胞線粒體熒光定性分析

比色皿或96孔板：用于熒光定量分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于活體細胞線粒體熒光定量分析

細胞流式儀：用于活體細胞線粒體熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 染色液（Reagent A）置入冰槽里融化， 稀釋液（Reagent B）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出10微升 染色液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管，加入890微升 稀釋液（Reagent B），混勻后，在冰槽里靜置，并標記為 染色工作液，放在暗室里。然后進行下列操作。

一、直接法

• 準備1個24孔細胞培養(yǎng)板的待測細胞，每孔鋪滿率達70％（約10⁵細胞數(shù)）
• 小心抽去細胞培養(yǎng)液
• 輕輕沿著孔壁加入1毫升  清理液（Reagent C）到細胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 小心抽去1毫升  清理液（Reagent C）
• 加入450微升含有 染色液（Reagent A） 和 稀釋液（Reagent B）的 染色工作液，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里，孵育20分鐘（注意避光）
• 小心抽去450微升 染色工作液
• 小心加入500微升 清理液（Reagent C）（注意：檢測前置于冰槽里）
• 即刻在倒置熒光顯微鏡下進行觀察（濾波器激發(fā)波長549nm，散發(fā)波長575nm ）――可見

亮橘紅色熒光；如果強度顯著減弱，表明線粒體膜電位受到破壞

二、間接法

• 準備1個12孔細胞培養(yǎng)板的待測細胞，每孔鋪滿率達70％（約30萬細胞數(shù)）
• 小心移出細胞培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管（收集懸浮細胞）
• 加入1毫升  清理液（Reagent C）到細胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 小心移出1毫升  清理液（Reagent C）到15毫升錐形離心管（收集洗脫細胞）
• 加入500微升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)孔表面
• 置入37℃培養(yǎng)箱1分種
• 輕輕抖動培養(yǎng)板，使細胞脫落，然后加入1毫升*細胞培養(yǎng)液
• 移入15毫升錐形離心管
• 放進 臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入50微升 清理液（Reagent C）
• 用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細胞顆粒群
• 轉(zhuǎn)入到1.5毫升離心管或細胞流式儀測試管
• 加入450微升含有 染色液（Reagent A） 和 稀釋液（Reagent B）的 染色工作液
• 輕度渦旋震蕩2秒
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里，孵育20分鐘（注意避光）
• 放進 臺式微型離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 清理液（Reagent C）（注意：檢測前置于冰槽里）

選擇一、（共聚焦）熒光顯微鏡觀察 

• 混勻后，移出50微升在載玻片上
• 即刻進行載玻片壓片，在熒光顯微鏡下進行觀察（濾波器激發(fā)波長549nm，散發(fā)波長575nm） ――可見亮橘紅色熒光；如果強度顯著減弱，表明線粒體膜電位受到破壞

選擇二、細胞流式儀分析

• 混勻后，即刻進行細胞流式儀分析：觀察50000個細胞以上

選擇三、熒光分光光度儀或熒光酶標儀測定

• 混勻后，移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色皿里
• 即刻進行熒光分光光度儀或熒光酶標儀測定（激發(fā)波長549nm，散發(fā)波長575nm），獲得相對熒光單位（RFU）：RFU值高表明線粒體膜電位正常

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次（0.5毫升工作液）操作
• 操作時，須戴手套
• 待測細胞建議不要過于饑餓或過度生長
• 避免使用固著液處理細胞
• 建議細胞染色完成后，即刻進行熒光檢測分析
• 孵育時，避免光照
• 健康細胞和線粒體呈現(xiàn)橘紅色；死亡或凋亡細胞及損傷線粒體呈現(xiàn)黯淡或無熒光
• 本公司提供FCCP溶液，作為線粒體膜電位破壞分子，觀察熒光顯著減弱現(xiàn)象
• 參考圖像

• 熒光顯微鏡：正常樣品（藍色為核染色）

2）細胞流式儀：上圖為正常樣品；下圖為FCCP處理樣品

• 本公司提供系列線粒體試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰