植物細胞氧化應激活性氧羥自由基原位熒光染色試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 植物細胞氧化應激活性氧羥自由基原位熒光染色試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑羥苯基熒光素，與細胞內羥自由基的反應，產生綠色熒光，來測定細胞內羥自由基活性氧族的生成和增加的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰老、代謝等的研究。其適用于各種新鮮植物組織（例如根尖、葉片等）和培養細胞等細胞內氧化應激活性氧羥自由基的分析。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩定，熒光清晰。

技術背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。其中羥自由基或氫氧基具有極度反應性和毒性，同時半衰期短（10^－9至10^－10秒）。其產生主要是水分子受到高能量放射后裂解、過氧化物和次氯酸反應、過氧化氫的還原、超氧化物的歧化等形成。在植物組織中，羥自由基將啟動放射性誘導損傷、攻擊植物蛋白和膜脂而引起氧化損傷。羥苯基熒光素（Hydroxyphenyl fluorescein；2-[6-(4’-Hydroxy)phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoic acid；HPF）是一種*自由通過細胞膜的染色劑，一旦與羥自由基反應，產生脫芐基（o-dearylation）作用，生成強烈熒光的熒光素（fluorescein）。據此證明植物細胞內羥自由基活性氧族的存在。

產品內容

 清理液（Reagent A） 100毫升

 固著液（Reagent B）  50毫升

 離析液（Reagent C）  20毫升

 染色液（Reagent D） 100微升

產品說明書   1份

保存方式

保存 染色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里； 固著液（Reagent B）和 離析液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細胞脫離

*細胞培養液（GMS12052）：用于細胞操作所需的培養基

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于染色液配制的容器

2毫升離心管：用于樣品操作的容器

載玻片：用于組織染色操作

解剖針：用于植物組織解剖

血細胞計數儀：用于細胞計數

（微型）臺式離心機：用于樣品處理

培養箱：用于染色孵育

比色皿或黑色96孔板：用于熒光定量分析的容器

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光分析

細胞流式儀：用于細胞染色分析

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于熒光定量分析

實驗步驟

方法一：活體組織染色

• 加上100微升 清理液（Reagent A）在載玻片上
• 切取新鮮植物根尖，放進載玻片上的 清理液（Reagent A）中
• 用解剖針小心壓碎根尖
• 小心移去 清理液（Reagent A）
• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）在根尖上
• 再加上5微升 染色液（Reagent D） 
• 放進37℃培養箱里孵育30分鐘
• 取出載玻片，移去染色液
• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）
• 小心移去 清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片，用拇指小心且垂直加壓
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發波長499nm，散發波長515nm——綠色熒光增強，表明羥自由基含量高 

方法二：組織固定染色

• 加上100微升 清理液（Reagent A）在載玻片上
• 切取新鮮植物根尖，放進載玻片上的 清理液（Reagent A）中
• 用解剖針小心壓碎根尖
• 小心移去 清理液（Reagent A）
• 小心加上2毫升 固著液（Reagent B）
• 室溫下，孵育3小時，避免干化
• 小心移去 固著液（Reagent B）
• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）
• 小心移去 清理液（Reagent A）
• 小心加上1毫升 離析液（Reagent C）
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心移去 離析液（Reagent C）
• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）
• 小心移去 清理液（Reagent A）

• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）在根尖上
• 再加上5微升 染色液（Reagent D） 
• 放進37℃培養箱里孵育30分鐘
• 取出載玻片，移去染色液
• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）
• 小心移去 清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片，用拇指小心且垂直加壓
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發波長499nm，散發波長515nm——綠色熒光增強，表明羥自由基含量高

方法三、培養植物細胞脫離染色

• 準備1瓶25cm²細胞培養瓶的待測細胞
• 小心抽去細胞培養液
• 加入3毫升  清理液（Reagent A）到細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面
• 小心抽去 清理液（Reagent A）
• 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養平面
• 置入37℃培養箱1分種
• 振動培養瓶，使細胞脫落
• 加入4毫升用戶自備的*細胞培養液
• 移入15毫升錐形離心管，充分混勻（注意：懸浮細胞直接從這一步驟開始）
• 移取10微升在血細胞計數儀上進行細胞計數
• 移出1 X 10⁶細胞到新的15毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升 清理液（Reagent A）
• 再加入5微升 染色液（Reagent D），混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育30分鐘，避免光照
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預冷的400微升 清理液（Reagent A），輕柔混勻細胞顆粒群
• 放進冰槽里
• 選擇下列方式之一進行操作：
  • 即刻進行細胞流式儀分析：波長488nm氬離子激光，觀察50000個細胞以上――

波峰右移，表明羥自由基含量高

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

1）移取10微升上述細胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片

2）激發波長499nm，散發波長515nm――

綠色熒光增強，表明羥自由基含量高

• 或使用熒光分光光度儀檢測（定量檢測）：

1）移取400微升上述細胞懸液到1毫升比色皿

2）加入600微升 清理液（Reagent A）

3）上下傾倒混勻數次

4）放進熒光分光光度儀：激發波長499nm，散發波長515nm――

RFU增高，表明羥自由基含量高

方法四、貼壁培養細胞染色

• 準備1個細胞培養24孔板的待測細胞，細胞鋪滿率達70％

（注意：可以使用載玻片，載玻片培養皿，35mm培養皿，和其它培養孔板，見注意事項4）

• 小心抽去細胞培養液
• 小心沿著孔壁加入500微升 清理液（Reagent A）到1個細胞培養孔，覆蓋培養孔表面
• 再加入2.5微升 染色液（Reagent D）
• 放進37℃細胞培養箱里孵育30分鐘
• 小心抽去染色液 
• 小心沿著孔壁加入500微升37℃預熱的 清理液（Reagent A）到細胞培養孔
• 選擇下列方式之一進行操作：

（A） 使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

激發波長499nm，散發波長515nm――綠色熒光增強，表明羥自由基含量高

•  使用熒光酶標儀檢測（定量檢測）：

激發波長499nm，散發波長515nm――RFU增高，表明羥自由基含量高

方法五、組織勻漿定量檢測

• 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定100毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入2毫升 清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進一個預冷的15毫升錐形離心管
• 加入預冷的2毫升 清理液（Reagent A）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入2毫升離心管，放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的2毫升離心管
• （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• （選擇步驟）即刻移入到2毫升離心管
• 移取5微升組織勻漿物進行蛋白定量檢測：建議使用  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒（GMS30030.1）
• 移取50微升組織勻漿物（樣品：100微克蛋白）或50微升 清理液（Reagent A）（背景對照）到1毫升比色杯里
• 加入950微升 清理液（Reagent A）
• 再加上5微升 染色液（Reagent D）
• 上下傾倒混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育30分鐘，避免光照
• 即刻放進熒光分光光度儀檢測：激發波長499nm，散發波長515nm——（樣品RFU-背景對照RFU）＝實際RFU：增加，表明羥自由基含量高

注意事項

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
•  固著液（Reagent B）和 離析液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全
• 孵育時，必須避免光照
• 建議染色完成后，即刻進行熒光檢測分析
• 本產品適合各種規格的培養細胞：載玻片，載玻片培養皿，35mm培養皿，和各種培養孔板，須相應調整操作用量：

• 本產品適合活體染色和固定染色；建議活體染色為佳
• 如果羥自由基濃度過低，可以延長孵育時間至60分鐘
• 根據不同組織類型，調整 染色液（Reagent D）的使用劑量（1：20至1：1000容量比），避免過度染色
• 激發波長可以選擇在485至500nm，散發波長505至550nm之間的任一波長
• 本公司提供系列活性氧分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定熒光清晰