細胞β-內酰胺酶報告基因活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 細胞β-內酰胺酶報告基因活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用化學方法，快速有效地裂解動物細胞，通過高速離心，獲得澄清細胞裂解懸液，在β-內酰胺酶反應體系里，以頭孢硝噻吩為黃色底物，水解所產生的紅色產物，呈現吸光峰值的變化，即采用比色法定量測定細胞裂解懸液制備樣品中的β-內酰胺酶活性，藉此建立一種簡單的定量評價報告基因的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。廣泛應用于基因組學、蛋白質組學和其它分子生物學研究。其適用于轉基因后的活體細胞外源性β-內酰胺酶活性分析。產品即到即用，性能穩定，參數優化，操作簡便、比色敏感。

技術背景

β-內酰胺酶（β-lactamase；EC3.5.2.6）屬于細菌酶蛋白家屬的成員之一，29KD單體蛋白（monomeric）。大量細菌分泌產生，分布在細菌周邊和細菌細胞漿內，通過水解酰胺鍵（amide bond），分解β-內酰胺（β-lactam）的4原子環狀結構，由此產生抗菌素抗性，例如青霉素類、頭孢菌素類（cephalosporins）、頭霉素類（cephamycins）、 碳青霉素烯類（Carbapenems）抗性。β-內酰胺酶功能上分成4大組，結構上分成4大類。β-內酰胺酶催化反應敏感有效，且容易測試。因此β-內酰胺酶成為嶄新的報告基因，替代傳統的β-半乳糖苷酶報告基因系統，可以在活體細胞內實時監測基因轉錄、檢測蛋白間相互作用、評價基因表達載體轉染的效果。基于頭孢硝噻吩（Nitrocefin），一種黃色底物，對于所有β-內酰胺酶具有敏感性，在β-內酰胺酶的催化下，水解產生紅色產物，通過486nm波長的吸光峰值分析，來定量分析β-內酰胺酶的活性。

產品內容

 清理液（Reagent A）     120毫升

 裂解液（Reagent B）    10毫升

 緩沖液（Reagent C）    20毫升

 底物液（Reagent D）   200微升

 陰性液（Reagent E）     2毫升

產品說明書     1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里； 底物液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

比色皿或酶標板：用于比色檢測的容器

恒溫水槽或培養箱：用于反應物孵育

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

• 樣品準備

• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升 清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

• 測定準備

• 開啟并設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長486nm，間隔5分鐘，讀數3次（共10分鐘），并置零
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化； 底物液（Reagent D）避免光照
•  緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
• 檢測實驗開始前，移取20微升 底物液（Reagent D）到1.5毫升離心管，加入180微升 陰性液（Reagent E），混勻，標記為 反應工作液，置于暗室里備用。

• 背景對照測定

• 移取780微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升 反應工作液
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升 陰性液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（10分鐘讀數－0分鐘讀數）

• 樣品測定

• 移取780微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升 反應工作液
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（10分鐘讀數－0分鐘讀數）

五、計算樣品活性

[（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 20.5（毫摩爾吸光系數）X 10（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾頭孢硝噻吩/分鐘

• 酶標板測定

• 在96孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取195微升 緩沖液（Reagent C）到96孔板中的所有孔中
• 分別加入25微升 反應工作液
• 輕輕搖動96孔酶標板
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入5微升 陰性液（Reagent E）或待測樣品（50微克蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動酶標板
• 即刻放進酶標儀檢測：10分鐘讀數和0分鐘讀數
• 活性計算

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 20.5（毫摩爾吸光系數）X 0.6（光徑距離；厘米）X 10（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾頭孢硝噻吩/分鐘

注意事項

• 本產品為20次（比色皿）和80次（酶標板）操作
• 建議使用核內表達的載體代替胞內表達的載體轉染或感染細胞或組織
• 本產品的各項參數達到*化
• 操作時，須戴手套
•  底物液（Reagent D）避免光照和反復凍融
• 用戶可以根據需求，配制 反應工作液，不宜存放
• 如果用戶樣品有限，轉染困難，且酶活性過低，建議使用細胞β-內酰胺酶報告基因活性熒光定量檢測試劑盒（GMS10093.1）
• 反應孵育完成后，即刻進行比色測定
• 測定值由低到高變化；測定持續10分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定10分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• β-內酰胺酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，每單位酶在單位時間內（每分鐘）水解1微摩爾的頭孢硝噻吩
• 本公司提供系列β-內酰胺酶檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感