細胞尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）活性比色法定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

 細胞尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過三肽化合物底物p-ERG-pNA受到尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的水解，釋放黃色對硝基苯胺，產生吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細胞裂解萃取樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體等）尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（urokinase-type Plasminogen Activator；uPA；EC3.4.21.73），又稱為尿激酶（urokinase；UK），屬于絲氨酸蛋白酶，存在于血液、細胞外基質和尿液中。尿激酶由411氨基酸構成，分子量為54KD，有3個結構域：絲氨酸蛋白酶結構域、kringle結構域和生長因子結構域。其主要的生理性底物為纖維蛋白溶酶原（Plasminogen），即纖維蛋白溶酶（plasmin）的酶原形式（zymogen），切離部位為Cys-Pro-Gly-Arg⊥Val -Val-Gly-Gly-Cys。一旦切離后激活，纖維蛋白溶酶參與細胞蛋白水解過程，包括血栓溶解（thrombolysis）和細胞外基質降解等。uPA與組織重構、修復、血管形成（angiogenesis）性疾病和腫瘤擴散有關。uPA的抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpins），即纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑（Plasminogen Activator Inhibitor；PAI）。基于人工合成的三肽化合物底物p-EGR-pNA（pyro-Glu-Gly-Arg-p- Nitroaniline；焦谷氨酸酰甘氨酰精氨酰對硝基苯胺）受到尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的水解，釋放有色對硝基苯胺，在分光光度儀（405nm 波長）下，測定吸光峰值的變化，來定量測定尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的活性。其反應系統為：

uPA

p-EGR-pNA-HCl       →          p-EGR-OH  +   pNA

                                （黃色）

產品內容

 清理液（Reagent A） 120毫升

 裂解液（Reagent B）  10毫升

 緩沖液（Reagent C）   2毫升

 陰性液（Reagent D）     1毫升

 底物液（Reagent E）   220微升

產品說明書      1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里； 底物液（Reagent E）避免光照和反復凍融；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲存的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

微型臺式離心機：用于樣品沉淀

培養箱：用于反應物孵育

96孔板或100微升1厘米光徑比色皿：用于樣品比色測定的容器

酶標儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照。然后進行下列操作。

• 樣品制備

• 準備好75cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁷細胞）
• 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升 清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

• 測定準備

• 準備好上述制備的待測樣品
• 設定好分光光度儀或酶標儀（溫度為37℃）：波長405nm，并置零

• 活性測定

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取85微升 緩沖液（Reagent C）到相應孔里
• 分別加入5微升 陰性液（Reagent D）或上述制備的待測樣品（50微克蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）
• 分別加入10微升 底物液（Reagent E）
• 輕輕搖動96孔板（注意：避免氣泡）
• 在37℃溫度下孵育60分鐘（注意：可見反應孔里呈現肉眼可見的黃色）
• 即刻放進酶標儀檢測或轉移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測
• 活性計算：

• 酶標儀檢測

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.10（毫升，測定容量）]÷[0.005（樣品容量，毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數）X 60（分鐘）X 0.6（厘米）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

• 比色皿檢測

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.10（毫升，測定容量）]÷[0.005（樣品容量，毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數）X 60（分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

注意事項

• 本產品為21次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復凍融
• 測定值由低到高變化；測定可持續60分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定60分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升；如果樣本酶活性過低，則可以延長反應孵育時間至16小時；其次增加樣本量（本公司提供   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑單位活性定義為：在37℃，pH 7..5條件下，每分鐘內能夠切離1微摩爾三肽化合物底物p-ERG-pNA所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列細胞蛋白酶學檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感