細胞/組織溶酶體粗提分離試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

  細胞/組織溶酶體粗提分離試劑是一種旨在從動物細胞或組織中分離出完整而純化的溶酶體細胞器的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適合于動物軟組織（肝或腦組織）和培養細胞的溶酶體的制備。產品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩定，分離產量和純度俱佳。

技術背景

溶酶體（lysosome）是一種普遍存在于真核細胞中的細胞器，含有酸性水解酶，例如酯酶、淀粉酶、蛋白酶、核酶等，分解各種細胞殘渣和廢棄物質，包括過多的或破損的其它細胞器、食物顆粒、吞噬的細菌和病毒等。其大小為0.5至1.5微米，球圓形，溶酶體內pH為5.0左右。溶酶體功能異常會引起溶酶體貯積癥（1ysosomal storage disorders；LSDs），例如家族性*?。?/span>Tay-sachs disease）和龐貝氏癥 （Pompe’s disease）。溶酶體細胞器的分離是現代細胞生物學研究的zui常用的手段之一。從任何組織或細胞分離溶酶體的技術方法基本上采用：*，通過機械或化學方法破裂細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過高速差速離心獲得溶酶體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的溶酶體。 

產品內容

  清理液（Reagent A）   毫升

  裂解液（Reagent B）   毫升

  凈化液（Reagent C）   毫升

  強化液（Reagent D）   毫升

  分離液（Reagent E）   毫升

  保存液（Reagent F）   毫升

產品說明書   1份

保存方式

保存  凈化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液（GMS12028）或PBS緩沖溶液（GMS12033）：用于清理細胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細胞脫離

*細胞培養液（GMS12052）：用于細胞處理所需的培養基

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

4℃臺式離心機：用于沉淀細胞

4℃超速離心機：用于分離細胞器成分

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織細胞

實驗步驟

• 動物軟組織溶酶體分離（組織勻漿法）

實驗開始前，將－20℃冰箱里的  凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升  凈化液（Reagent C）和xx毫升的  裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為  裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

• 手術取出動物組織，并秤重以確定1克組織重量（實驗前使動物空腹12至24小時）
• （選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升  清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進一個預冷的15毫升錐形離心管
• 加入xx毫升預冷的  裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）（注意：參見注意事項8）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為12000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒 
• 加入xx毫升預冷的  分離液（Reagent E），混勻
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 放進4℃超速離心機離心15分鐘，速度為25000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體沉淀物
• （選擇步驟）加入xx毫升預冷的  保存液（Reagent F）
• （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心15分鐘，速度為25000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入xx微升  保存液（Reagent F），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里

二、動物軟組織溶酶體分離（化學處理法）

實驗開始前，將－20℃冰箱里的  凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升  凈化液（Reagent C）和xx毫升的  裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為  裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

• 手術取出動物組織，并秤重以確定1克組織重量（實驗前使動物空腹12至24小時）
• （選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升  清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入一個液氮凍存管
• 即刻放入液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入xx毫升預冷的  裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入xx微升預冷的  強化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項9）
• 加入xx毫升預冷的  保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為12000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒 
• 加入xx毫升預冷的  分離液（Reagent E），混勻
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 放進4℃超速離心機離心15分鐘，速度為25000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體沉淀物
• （選擇步驟）加入3毫升預冷的  保存液（Reagent F）
• （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心15分鐘，速度為25000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入500微升  保存液（Reagent F），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里

三、動物細胞溶酶體分離（細胞勻漿法）

實驗開始前，將－20℃冰箱里的  凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升  凈化液（Reagent C）和xx毫升的  裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為  裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

• 準備5至10瓶75cm²細胞培養瓶的細胞（10⁷），直至細胞生長鋪滿整個培養表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面，然后抽去
• 重復實驗步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
• 置入37℃培養箱3分種
• 輕輕手擊震動培養瓶，使細胞脫落，
• 分別加入10毫升用戶自備的*細胞培養液
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的  清理液（Reagent A），混勻細胞
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的  裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約20至40下）（注意：參見注意事項8）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為12000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒 
• 加入xx毫升預冷的  分離液（Reagent E），混勻
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 放進4℃超速離心機離心15分鐘，速度為25000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體沉淀物
• （選擇步驟）加入xx毫升預冷的  保存液（Reagent F）
• （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心15分鐘，速度為25000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入x微升  保存液（Reagent F），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里

四、動物細胞溶酶體分離（化學處理法）

實驗開始前，將－20℃冰箱里的  凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升  凈化液（Reagent C）和xx毫升的  裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為  裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

• 準備5至10瓶75cm²細胞培養瓶的細胞（10⁸），直至細胞生長鋪滿整個培養表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面，然后抽去
• 重復實驗步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
• 置入37℃培養箱3分種
• 輕輕手擊震動培養瓶，使細胞脫落
• 分別加入10毫升用戶自備的*細胞培養液
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的  清理液（Reagent A）
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的  裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入xx微升預冷的  強化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項9）
• 加入xx毫升預冷的  保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為12000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒 
• 加入xx毫升預冷的  分離液（Reagent E），混勻
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 放進4℃超速離心機離心15分鐘，速度為25000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體沉淀物
• （選擇步驟）加入xx毫升預冷的  保存液（Reagent F）
• （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心15分鐘，速度為25000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入xx微升  保存液（Reagent F），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里

注意事項

• 本產品為10次（1克動物組織或 10⁸細胞）操作
• 所有操作均須嚴格在4℃或以下狀態進行
• 操作時，須戴手套
• 操作時，須無菌操作，避免污染母液，尤其是  裂解液（Reagent B）和  分離液（Reagent E）
• 建議使用足夠的樣品量
• 建議嚴格控制操作時間
• 通常勻化次數為20至40下（或細胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態，但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加勻化次數
• 通常孵育5分鐘（不宜超過5分鐘）達到80％的細胞裂解為理想狀態，但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數
• 對于難以裂解的細胞，例如HeLa細胞，采用物理勻漿法是優先推薦的技術處理
• 通常1克動物組織或 10⁸細胞的溶酶體含量為300微克左右溶酶體蛋白

11． 如果需要獲得99％以上純度的溶酶體，使用  細胞/組織高質純化溶酶體分離試劑盒－GMS10118.3 

• 溶酶體標志酶活性測定，建議使用  通用型N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性比色法定量檢測試劑盒—GMS70031.1和  純化溶酶體酸性磷酸酶活性比色法定量檢測試劑盒—GMS50318.3 
• 溶酶體形態和功能染色，建議使用  細胞溶酶體形態染色試劑盒—GMS10121和  純化溶酶體功能中性紅檢測試劑盒—GMS10323 
• 本公司提供系列溶酶體分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定分離的溶酶體內外膜完整
• 本產品經鑒定分離的溶酶體維持正常活性
• 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶和核酶