RNA 甲基化是表觀遺傳學內容的重要內容之一， 其中 m6A（N6-methyladenosine，6- 甲基腺嘌呤，化學結構見圖 1）較為常見的一種修飾方式。m6A 是一種動態可逆的修飾方式，在轉錄后調控中發揮作用，其在調控基因表達、剪接、RNA 編輯、RNA 穩定性、控制 mRNA 壽命和降解、介導環狀 RNA 翻譯 [1] 等方面扮演重要角色，具有重要的研究意義（見圖 2）。

圖 1.6- 甲基腺嘌呤化學結構及可逆反應過程

圖 2. 動態修改的 m6A 修飾及介導的生物學功能 [2]

M6A 甲基化修飾是由一個多蛋白復合物介導產生，目前已知這個復合物的成分包括 METTL3，METTL14 和 WTAP；而負責擦除甲基化修飾基團的則由去甲基化酶 FTO 和 ALKBH5 所承擔。在細胞核中的 HNRNPC 負責識別 m6A 修飾基團，并介導 mRNA 前體的選擇性剪接。而另外一個 m6A 識別蛋白 HNRNPA2B1[3] 則促進 pri-miRNA 加工成 pre-miRNA。在細胞質中，不同的 M6A 位點識別蛋白介導不同的功能。YTHDF1 和 YTHDF3[4,5] 識別 m6A 修飾 mRNA，通過與起始因子及核糖體相互作用促進蛋白質翻譯，eIF3 識別蛋白也會直接綁定到 mRNA5’UTR 端的 m6A 位點參與翻譯起始。而另外一個識別蛋白 YTHDF2 與 m6A 識別將導致 mRNA 的降解。目前還存在其他未知的 m6A 識別蛋白，相關研究的繼續開展將有利于解開 m6A 在 mRNA 運輸、翻譯和存儲等功能的謎團。

雖然 RNA 甲基化的研究在上世紀七十年代就開始，但是由于技術上的局限一直停滯不前，直到zui近幾年在何川教授等團隊的帶領下，通過不斷的技術創新和難點攻克，m6A 等甲基化修飾的研究才不斷取得突破性的研究成果。

關于 m6A 的研究方向，主要涉及 m6A 本身的修飾過程涉及的甲基化酶和去甲基化酶，以及 m6A 識別蛋白。這個研究方向的研究技術難度較大，涉及較多生化實驗。其次是 m6A 修飾譜構建及作用機制，特別是構建疾病細胞模型或者發病組織的 m6A 修飾譜，涉及較為關鍵的 MeRIP-seq (methylated RNA immunoprecipitation sequencing) 高通量測序技術 [6]。第三個方向是 m6A 修飾失衡介導相關基因異常（可變剪切、穩定性、翻譯、miRNA 調控）在所發揮的作用。第四個方向是通過大數據分析，利用公共數據資源對 m6A 修飾涉及的基因進行表達量統計，并進行共表達分析預測其可能調控的靶基因，進而進行功能驗證。（見圖 3）

圖 3. m6A 的主要研究方向

下面我們將重點介紹其中一種研究方向的設計思路，并提供相應的技術服務和解決方案。

研究方向：構建轉錄組 m6A 修飾圖譜

研究目的：構建目標樣本的 m6A 修飾譜，揭示在特定生命過程或者疾病模型中的 m6A 圖譜。

實驗樣本：細胞、組織、提取后的總 RNA（限定有參基因組物種）

關鍵技術：meRIP-seq (methylated RNA immunoprecipitation sequencing)，也稱 m6A-seq

zui近幾年來 m6A 研究迅速發展，正是得益于 meRIP-seq 技術的開發及應用。meRIP-seq 高通量測序技術的出現，能夠檢測全轉錄組不同的 RNA 甲基化，是成功發現 RNA 甲基化機理及功能的關鍵技術。

MeRIP-seq 技術將甲基化 DNA 免疫共沉淀 (methylated DNA immunoprecipitation， MeDIP) 技術、RNA 結合蛋白免疫共沉淀 (RNA immunoprecipitation，RIP) 技術和 RNA 測序 (RNA sequencing，RNA-seq) 技術組合起來，高精度地檢測全基因組 (或全轉錄組) 范圍內的 RNA 甲基化。MeRIP-seq 技術采用免疫共沉淀方法，即甲基化 RNA 特異性抗體與被隨機打斷的 RNA 片段進行孵育，抓取有甲基化修飾的片段進行測序；同時需要平行測序一個對照 (control) 樣本，對照樣本用于消除抓取帶有甲基化片段過程中的背景。然后將免疫共沉淀 (IP) 樣本和對照樣本中的序列片段對比 (或定位) 到參考基因組 / 轉錄組上，檢測 RNA 甲基化位點。對照樣本測量對應 RNA 的表達量，本質上是 RNA-seq 數據 (圖 4)[7]。

圖 4 .MeRIP-seq 技術檢測 m6A 技術流程 [4]

實驗分組設置：

細胞模型 實驗組 VS 對照組，建議 3:3

組織模型 正常組 VS 疾病組，建議 5:5

組內對照：IP 組 VS in put 組 *

注 *：input 組主要用于比較鑒定 IP 組的抗體特異性結合，是*的組分

測序模式：PE100/150

測序數據：3-6G

關鍵分析內容：m6A 的基本特征

m6A 修飾基本特征分析主要包括以下三個方面

特征一、peak 在基因元件的分布

本分析主要通過對測序數據比對后，分析相關序列在基因不同原件的分布。主要方法是將 5-UTR，CDS，3-UTR 各劃分為等長的 20 個 bin，統計 peak 落在每個 bin 中 peak 的百分比。Peak 和 bin 的 overlap 長度占 50% 以上就算落在了這個 bin 上。基因元件分布圖見圖 5、圖 6：

圖 5 Peak 在元件中的分布曲線圖。綠色表示 CDS，藍色表示 UTR，灰色的細線表示 start-coden 的起始位點和 stop-coden 的終止位點

圖 6 Peak 分布條形圖 ， 橫坐標表示各元件，縱坐標表示落在元件中的 peak 百分比

特征二、 reads 在基因元件的分布

找到富集區域（peak）后，統計 reads 在元件中的分布情況。針對 peak，分別提取 IP 和 Input 在 peak 區間的 reads，reads 和 peak overlap 上 50% 以上就算 reads 落在 peak 區間 , 同時 normalized IP 和 Input 的數據量比例。(如圖 7)

圖 7 reads 在元件中的分布曲線圖。綠色表示 CDS，藍色表示 UTR，，縱坐標表示 normalized 后的覆蓋深度

特征三、Peak 關聯基因的特征

針對 Peak 關聯上的基因 ， 看它的 stop-coden、start-coden 是否有 m6A 富集區域 （peak）， 以此將 gene 分為 4 類：PeakStart (m6A peaks around start codon), PeakStop (m6A peaks around stop codon), PeakBoth (m6A peaks around both start and stop codons) and others。

圖 8 peak 關聯基因特征 pie 圖

兩樣品 peak overlap 占 50% 以上則定義為 common peak， 其他的定義為 special peak。共有和* peak 的韋恩圖如下 (見圖 9)：

圖 9 兩樣本 peak 韋恩圖

通過 以上的 m6A 特征分析，后續的重要分析還包括針對差異 peak 來分析關聯的基因，以及對這些基因進行 GO 和 KEGG 分析。其次，還可以針對目前的研究熱點，對 peak 進行 circRNA 分析，有利于指導環狀 RNA 翻譯功能的研究工作 [1]。

另外，通過和同組樣本轉錄組測序數據的聯合分析，可以進一步深挖 m6A 修飾對可變剪切、RNA 編輯、RNA 表達豐度、miRNA 加工生成等方面的影響；也可以結合蛋白質譜定量檢測，研究 m6A 修飾與蛋白質翻譯的關系，指導進一步的深入功能機制研究。

自 2011 年何川教授發表 FTO 作為 m6A 去甲基化酶 [8] 的研究工作以來，m6A 的研究深度和廣大快速發展。為了幫助國內生物醫學特別是腫瘤領域的科研人員更好的理清 m6A 的研究思路，表觀生物制定以下疾病相關 m6A 研究策略以供參考。

研究案例： FTO 通過 RNA 修飾機制發揮促癌作用

2017 年 1 月，辛辛那提大學研究人員在 Cancer Cell 雜志發表論文 [9]，報道了發現肥胖相關蛋白 FTO 能夠通過 RNA 修飾機制調節一系列基因的表達，發揮重要的促癌作用，導致白血病細胞增多并抑制癌細胞對藥物的應答。

研究人員利用 100 個人類急性髓系白血病（AML）樣本以及 9 個正常對照樣本的芯片數據，還對其他一些大規模 AML 樣本數據進行了分析。他們發現 FTO 在不同亞型的白血病樣本中都存在高表達。（見圖 10）

圖 .10 FTO 基因在 AML 樣本中存在高表達

圖 11. FTO 靶向調控 ASB2 和 RARA 等抑制白血病細胞生長的基因，通過去甲基化修飾后，反向抑制 ASB2 和 RARA 的功能

實驗證明 FTO 靶向調控 ASB2 和 RARA 等抑制白血病細胞生長的基因，通過去甲基化修飾后，導致靶 mRNA 穩定性提高，也相應提高了蛋白質含量，這個結果與之前認為的 m6A 導致 mRNA 穩定性下降的結論出現了相反。另外通過沉默 m6A 的識別蛋白 YTHDF1 和 YTHDF2，發現只有 YTHDF2 能影響到 ASB2 和 RARA 的 mRNA 水平，但是對于這兩個蛋白的豐度卻沒有產生作用。提示還有新的調控機制尚待發現。

文章zui后提出了 FTO---ABS2/RARA 調控軸的機制模型：由于融合基因等因素的影響如 MLL-fusion 蛋白等刺激導致 FTO 表達上升，降低靶基因如 ASB2，RARA 等的 mRNA m6A 修飾，抑制其功能發揮，促進了細胞增殖和抑制細胞分化，并且抑制癌細胞對藥物的應答。

圖 12. 機制模型

這項研究證實 m6A 修飾機制在白血病發育和藥物應答過程中有重要作用。靶向 FTO 信號途徑可能成為治療白血病的一個新的策略。另外 FTO 也在其他一些實體瘤中發揮促癌作用，因此該研究結果可能對癌癥生物學研究和癌癥治療方法的開發有更廣泛的影響。

參考文獻：

[1] Zhou C, Molinie B, Daneshvar K, et al. Identification and characterization of m6A circular RNA epitranscriptomes[J]. bioRxiv, 2017: 115899.

[2] Cao G, Li H B, Yin Z, et al. Recent advances in dynamic m6A RNA modification[J]. Open biology, 2016, 6(4): 160003.

[3] Alarcón C R, Goodarzi H, Lee H, et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m 6 A-dependent nuclear RNA processing events[J]. Cell, 2015, 162(6): 1299-1308.

[4]Li A, Chen Y S, Ping X L, et al. Cytoplasmic m6A reader YTHDF3 promotes mRNA translation[J]. Cell research, 2017.

[5]Yang Y, Fan X, Mao M, et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine[J]. Cell research, 2017.

[6] Dominissini D, Moshitch-Moshkovitz S, Schwartz S, et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq[J]. Nature, 2012, 485(7397): 201-206.

[7] 劉戀, 張紹武, 孟佳, 等. 高通量 RNA 甲基化測序數據處理與分析研究進展 [J]. Progress in Biochemistry and Biophysics, 2015, 42(10): 891-899.

[8] Jia G, Fu Y, Zhao X, et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO[J]. Nature chemical biology, 2011, 7(12): 885-887.

[9] Li Z, Weng H, Su R, et al. FTO plays an oncogenic role in acute myeloid leukemia as a N 6-methyladenosine RNA demethylase[J]. Cancer Cell, 2017, 31(1): 127-141.