Emfret Analytics GmbH（成立于 2002 年）專注于生物醫學研究（即血管生物學）中單克隆抗體的生產、表征、衍生化和供應。

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免疫組化（用丙酮固定的冰凍切片）

請注意：不建議對（對）甲醛固定的樣品進行免疫染色，因為在這些條件下，大多數大鼠抗體在小鼠組織上只能產生較差的結果。

1. 將冷凍組織的切片安裝在載玻片上，并在 4°C 的冰冷 100% 丙酮中固定 20 分鐘。在室溫下干燥樣品過夜。

2. 為了盡量減少試劑體積，可以用防水筆在載玻片上的組織部分周圍畫一個疏水環。在接下來的所有程序中，這個被包圍的區域不應干涸。因此，建議在潮濕的盒子中進行孵化步驟。

3. 在 PBS 中孵育幻燈片 20 分鐘。

4. 當使用過氧化物酶偶聯的二抗時，在室溫下用 0.03% H2O2 孵育載玻片 10 分鐘以抑制內源性過氧化物酶活性。在 PBS 中沖洗載玻片 3 次，每次 5 分鐘。

5. 將玻片在室溫下在封閉溶液（來自待使用的二抗宿主物種的血清）中孵育 1 小時，在 PBS 中稀釋 1:10 或 1:100。

6. 用封閉溶液中的一抗 (2-10 µg/ml) 覆蓋載玻片，并在室溫下孵育 2 小時。

7. 從載玻片上吸干多余的液體，并在 PBS 中沖洗 3 次，每次沖洗 5 分鐘。

8. 根據制造商的說明，用在封閉溶液中稀釋的熒光團或過氧化物酶偶聯的二抗（例如親和純化的驢抗大鼠 IgG-FITC 或 -HRP，Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）覆蓋載玻片。在 RT 中孵育 1 小時。

9. 從載玻片上吸干多余的液體，并在 PBS 中沖洗 3 次，每次沖洗 5 分鐘。

10. a) 熒光染色的樣品可以通過熒光顯微鏡直接分析。

11. b) 為了觀察過氧化物酶標記的結構，用新鮮制備的 3-氨基-9-乙基咔唑 (AEC) 底物蓋住載玻片并孵育直至在顯微鏡下可見紅色染色，時間可在 5 到 30 分鐘之間變化。在橙色背景染色發生之前用去離子水沖洗停止反應。對于復染，用蘇木精孵育樣品 30-240 秒，并用流動的溫水沖洗載玻片 20 分鐘。使用包埋水溶液（例如 Aquatex、Merck）安裝切片。

    
    

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