動物組織DNA的制備
一、實驗原理
提取核酸的基本程序包括細胞破碎-解聚核蛋白并去除蛋白質-沉淀核酸并去除其它雜質三步。破碎細胞的方法很多，高等動植物材料常用液氮研磨法。
核蛋白利用DNA核蛋白在0.14mol/L Nacl鹽溶液的溶解度很低的特點而實驗其與RNA核蛋白分離，殘存的RNA經 R Nase水解而去除。
蛋白質經蛋白酶水解，并經苯酚、Trichloromethane變性而分開。提純過程中的DNA酶活性經低溫操作并用SDS解聚或檸檬酸三鈉和EDTA.Na2等螯合劑抑制。逐漸純化的DNA經乙醇或異丙醇沉淀而收集，終實現DNA分離純化之目的。
二、實驗用品
（一）器材
（1）離心機。
（2）水浴鍋。
（3）紫外分光光度計。
（4）研缽、液氮、帶蓋離心管。
（二）試劑
（1）蛋白酶K:用水或TEN9溶液溶解成10mg/ml，或直接用粉末。
（2）TEN9 pH9.0:稱取Tris6.05g EDTA.Na237.224g和NaCL 11.688g按順序溶于蒸餾水中，以HCL調PH9.0。
（3）TE溶液：50mmol/L Tris.HCL(PH8.0)-10mmol/L EDTA.Na2(PH8.0)。
（4）SS-phenol:以Tris平衡重蒸酚至PH8.0，加入0.1%的8-羥基喹啉（使溶液呈黃色，防止酚的氧化）。
（5）1mmol/L Tris.HCL(PH8.0)：Tris121.14g溶解于蒸餾水中，以HCL調PH至8.0定容至1L。
（6）20% SDS:20g SDS溶于100ml蒸餾水中，配制時要小心，SDS對呼吸道有強烈的刺激，且毒性較大。
（7）RNase A 若試劑含有痕量DNase，用*℃ 10min滅活DNase。
（8）3mol/L NaAc,pH6.5:稱取NaAc.3H2O408.1g溶于蒸餾水中，HAc調PH至6.5后定容至1L。
TEN9、 Tris.HCL、NaAc均需高壓滅菌。
（三）材料
新鮮兔肝或雞肝。
二、實驗程序
（一）操作方法
1.操作步聚
（1）在液氮存在的條件下，于研中將5g動物組織碾成細粉（約需20~30min）。
（2）待液氮揮發后，將細粉轉至50ml帶蓋的離心管中，加入20mlTEN9和RNase(100µg/ml),混合均勻，加入1ml 20%SDS，將離心管上下顛倒幾次，并繼續輕揺10min。
（3）加入10mg蛋白酶K粉末，慢速攪拌使之溶解并混勻。
（4）在37℃至55 ℃保溫2~4小時，其間不時地輕搖。
（5）如需要，再加入10mg蛋白酶K粉末，繼續保溫至少2h，使組織充分消解。
（6）加入20ml SS-phenol,溫和顛倒離心管，使兩相充分混合，形成類似乳濁液狀。
（7）室溫，10000r/min離心10min，使混合液清晰分相（如分層不明顯，可適當加大離心力及離心時間）。上層水相含DNA，中間為變性蛋白質，下層為酚相。
（8）用大口吸管將上層水相轉至另一只離心管中，棄去界面相和酚相。
（9）將第6~8步重復進行幾次，直至中間相*消失（蛋白質必須去除干凈，否則對DNA的溶解及酚切都不利）。
(10)離心后，將水相轉到透析袋中以去除小分子物質。在TE中透析（稀釋因數應大于1000，稀釋因數指外界溶解與待透析液體積比的累積乘積），并用磁力攪拌器攪拌，提高透析效率，2h后轉至4℃繼續透析4h或過液（開始時，溶液中含大量的SDS，低溫下易析出，因此開始時必須先在溫室透析，由于透析袋較昂貴，用后可用TE浸泡，煮沸10min,可續用），可靜止透析。
（11）將透析后的溶液轉至50ml離心管中，加入NaAc溶液，使其終濃度為0.3mol/L,再加入0.8體積的異丙醇，溫和混勻（亦可用2倍體積的乙醇代替異丙醇，但可能使沉淀體積過大）。
（12）用玻璃棒繞起或鉤出呈現纖維狀的DNA，由于異丙醇不易干燥，可用70%的乙醇快速沖洗干燥后，在2~5ml TE中*溶解，并置冰箱保存。
（13）測定此DNA溶液在260nm和280nm波長下的OD值，此值應大于1.7.如果小于1.7，則說明含較多的蛋白，需加少量蛋白酶K保溫后，用SS-酚進一步抽提。另外，235nm處為鹽類及小分子化合物的吸收峰，因此應大于1.7。
2得率的計算
由于1OD260的DNA濃度為50µg/ml，因此DNA得率可按下公式計算：
1g新鮮組織的DNA含量=OD260×50×溶解體積/組織鮮重（µg DNA/g）。
19
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務