操作賽默飛熒光定量PCR儀需要按照一系列步驟來配置設備、設置實驗程序、運行實驗和分析數據。以下是詳細的操作步驟和注意事項，幫助您順利完成實驗。
一、準備工作
在正式操作賽默飛熒光定量PCR儀前，請確保以下準備工作已完成：
檢查儀器狀態：
檢查反應體系：
確保計算機和儀器連接正常：
二、創建實驗程序
打開儀器：
進入實驗設置界面：
輸入實驗信息：
設置反應體系：
反應體積：根據實驗需求設置反應體積（常見體積有20 μL、25 μL、50 μL等）。
樣品信息：輸入樣品類型和濃度信息。確保樣品濃度與反應體系相匹配。
引物/探針選擇：輸入或選擇所使用的引物和探針信息。確保熒光探針的選擇正確，并且與所用的熒光染料兼容。
三、設置熱循環條件
設置溫度和時間：
變性溫度：通常設置在94-98°C之間。
退火溫度：根據引物的Tm值，通常設置在50-65°C之間。
擴增溫度：一般設置為72°C（適用于大多數DNA聚合酶）。
延伸時間：根據PCR產物的長度設定，通常設置為每千堿基15秒。
設置循環次數：
熔解曲線分析（可選）：
四、選擇熒光檢測通道
選擇適當的熒光染料：
設置熒光信號采集時間點：
五、啟動實驗
檢查所有設置：
儀器運行：
六、數據分析
實驗完成后查看數據：
數據分析選項：
Ct值分析：根據熒光信號的變化，自動計算各樣本的Ct值，并進行基因定量。
標準曲線分析：如果需要定量分析樣本的濃度，可以通過標準曲線法進行分析。
熔解曲線分析：對PCR產物進行熔解曲線分析，檢查擴增產物的特異性。
導出數據：
七、實驗結束后的注意事項
清潔儀器：
保存實驗數據：
檢查儀器運行狀態：
八、常見問題及解決方法
信號過低或過高：
非特異性擴增：
實驗反應失敗：
總結
操作賽默飛熒光定量PCR儀需要按步驟配置實驗程序、設置反應體系、選擇合適的熱循環條件和熒光探針通道。儀器的智能化設計使得操作相對簡便，但仍然需要細致地檢查設置和反應體系，確保實驗的順利進行。通過合理設置和分析，您可以得到高質量的定量PCR結果。
中級會員·2年
