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杭州實了個驗生物科技有限公司
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賽默飛 QuantStudio 5 熒光定量 PCR 儀操作規程
一、目的
為確保賽默飛 QuantStudio 5 實時熒光定量PCR儀的正確使用，提高實驗效率，確保實驗數據的準確性和重復性，特制定本操作規程。該規程適用于分子生物學、基因表達分析、核酸檢測等相關實驗中的PCR檢測工作。
二、適用范圍
本規程適用于使用賽默飛 QuantStudio 5 實時熒光定量PCR儀進行核酸擴增和熒光定量檢測的實驗操作人員。適用場景包括科研實驗室、醫療檢測機構、食品和環境檢測單位等。
三、儀器簡介
QuantStudio 5 是賽默飛生命科學儀器平臺推出的一款實時熒光定量PCR設備，具備96孔與384孔兩種格式版本。該儀器配置靈敏的熒光檢測系統和高精度溫控模塊，配套Design and Analysis軟件進行數據處理和可視化分析，支持多種應用場景。
主要技術參數：
檢測通道：最多支持6個熒光通道
熒光染料兼容性：FAM、SYBR Green、VIC、ROX、Cy5 等
樣品通量：96孔（0.2 mL）或384孔板
溫控精度：±0.25℃
升降溫速率：最大4.0℃/秒
最小檢測體積：10 μL（推薦），5 μL為限
光學系統：獨立激發和發射濾光片，快速濾片切換
軟件平臺：QuantStudio Design and Analysis 軟件
數據輸出格式：Excel、PDF、CSV等
四、使用準備
1. 儀器開機檢查
打開主機電源，檢查設備狀態燈是否正常（綠色為正常）
確保計算機與主機通過USB或局域網連接
啟動QuantStudio軟件，登錄用戶賬戶
檢查樣品艙是否干凈，無液體殘留或雜質
確保熒光濾光片和溫控板無損傷、無污染
2. 實驗準備
準備反應體系，包括引物、探針、酶、緩沖液及模板核酸
樣本混勻后加樣至PCR板或試管中，封板并輕輕離心去除氣泡
樣本總量建議控制在10–20 μL，確保PCR反應效率
使用推薦的光學透明封板膜，避免熒光信號干擾
3. 模板與耗材管理
使用專用PCR板（0.2 mL）和光學封板膜
樣本添加順序應按照軟件設定模板進行，確保板位與樣本對應
樣品編號應統一命名，便于后續分析追蹤
若實驗涉及多個通道檢測，確保熒光染料無交叉干擾
五、操作流程
1. 實驗設置
打開軟件，點擊“新建實驗"
選擇實驗類型（定量PCR、熔解曲線分析、相對定量等）
選擇熒光染料和檢測通道，匹配實驗方案
設定PCR擴增程序，如：
95℃ 15秒
60℃ 60秒（熒光采集）
初始變性：95℃ 10分鐘
擴增循環（40 cycles）：
設定板圖：將樣本、陰性對照、陽性對照、標準品標注至對應孔位
保存方法模板文件，便于重復使用
2. 加載樣品與運行
打開儀器樣品艙，將96孔PCR板平穩放置在加熱模塊上
關閉樣品艙蓋，確保均勻受熱
點擊“開始運行"按鈕，系統將執行程序并實時采集數據
實驗過程中可查看擴增曲線，監測熒光信號變化
3. 實驗完成與數據分析
實驗結束后，系統自動生成Ct值表格和擴增圖
可進行標準曲線分析、基因表達比值計算、熔解曲線分析等
可導出數據報告，包括Ct值、擴增效率、圖表等格式
根據需求保存為PDF、Excel或圖像文件，進行后續統計分析
4. 實驗結束后的處理
移除PCR板并按廢物處理流程處置
用干凈棉簽或無塵紙巾清潔加熱模塊表面
關閉軟件與主機，切斷電源，蓋好防塵罩
核查實驗記錄，補充試劑使用情況與樣本處理信息
六、注意事項
實驗期間盡量避免樣品艙打開，防止溫控系統紊亂
PCR板應均勻加樣，避免氣泡產生或液體溢出
使用專用熒光染料，勿自行替換未驗證的染料
實驗過程中應佩戴防護手套，避免污染反應體系
所有樣本及耗材使用后應規范處置，防止污染環境
每次使用前應檢查儀器狀態，出現異常及時聯系維修人員
盡量使用模板文件，提高操作一致性與數據可比性
七、常見問題與處理
| 問題 | 原因分析 | 解決措施 |
|---|---|---|
| Ct值偏高或不一致 | 模板濃度低、移液誤差、氣泡干擾 | 重新提取模板，校驗加樣操作 |
| 無熒光信號 | 熒光探針降解、通道設置錯誤 | 更換探針，檢查軟件設置 |
| 曲線形態異常 | 反應液污染、酶失活 | 檢查試劑有效期與保存方式 |
| 通道干擾 | 多重PCR染料重疊 | 調整檢測通道設置或使用校正板 |
| 系統報錯 | 軟件故障或硬件接觸不良 | 重啟設備或聯系技術支持 |
八、維護與校準
1. 日常維護
每次使用后進行外觀清潔
保持儀器通風口暢通，防止過熱
檢查電源線、USB或網絡連接狀態
2. 定期校準
光學系統與溫控模塊應根據廠商推薦周期進行校準
可使用賽默飛提供的校準板進行自檢
校準應由具備資格的人員或廠家技術支持人員執行
記錄每次校準與維護結果，備查
九、安全與應急處理
實驗操作遵守生物安全規定，使用生物安全柜處理高風險樣本
熒光染料避免直接接觸皮膚和眼睛
如遇試劑泄漏，立即使用70%乙醇或漂白劑進行清理
設備發生電氣故障時，立即斷電并通知相關技術人員處理
實驗過程中如發現異常升溫或煙霧，應立即停止運行并檢查電源系統
十、附錄：推薦PCR反應體系（以20 μL為例）
| 成分 | 體積 | 說明 |
|---|---|---|
| 2× qPCR Master Mix | 10 μL | 含酶和緩沖體系 |
| 引物（前/后） | 各0.4 μL | 最終濃度約200 nM |
| 探針或SYBR Green | 0.2–0.4 μL | 根據染料類型選擇 |
| 模板DNA | 1–2 μL | 10–100 ng |
| 無核酸水 | 補足至20 μL | 保證總體積一致 |
