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杭州實了個驗生物科技有限公司
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賽默飛QS12k型實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System）是賽默飛公司推出的一款高通量、高靈敏度的實時熒光定量PCR儀器，廣泛應用于基因表達、基因分型、突變檢測以及病原檢測等分子生物學研究領域。以下是關于如何使用該儀器的詳細步驟和注意事項。
1. 設備概述
QuantStudio 12K Flex PCR儀具備以下特點：
高通量支持：支持12,000個樣品的實時PCR分析，適用于大規模數據采集。
多通道熒光檢測：儀器支持最多6個熒光通道，可同時進行多重PCR反應，適用于多種熒光染料的檢測。
靈活的實驗設置：支持多種實驗格式，包括96孔板、384孔板，滿足不同實驗需求。
高精度熱循環系統：精準的溫控系統和均勻的溫度分布，確保PCR反應的一致性和可靠性。
2. 實驗準備
2.1 安裝與檢查
在開始使用QuantStudio 12K Flex PCR儀之前，需要確保設備已正確安裝并連接好所有必需的外部設備，包括電源、計算機（如果使用外部軟件進行數據分析）、網絡連接等。
位置選擇：選擇一個穩定的環境，避免設備受到電磁干擾、震動和溫度波動。
儀器檢查：打開設備電源后，進行自檢，確保設備的硬件系統（如溫控系統、熒光檢測系統等）運行正常。
2.2 樣品和試劑準備
DNA模板：根據實驗的目的準備DNA模板。確保模板的純度和濃度適合定量PCR實驗。
引物和探針：根據實驗的需求，設計和準備適合的引物和探針?？梢允褂肨aqMan探針或者SYBR Green染料等。
PCR反應體系：通常包括DNA模板、引物、探針、熒光染料、PCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶等。
配制PCR反應液時，應根據所使用的試劑盒的說明書或具體實驗設計，確保反應體系的準確性。
2.3 樣品加載
將PCR反應混合物和模板加載到PCR板中，通常使用96孔板或384孔板。加載樣品時，應避免產生氣泡，確保每個孔中反應液的體積一致。
3. 設置實驗程序
3.1 創建新實驗
打開QuantStudio 12K Flex PCR儀的觸摸屏界面或通過計算機進行操作，選擇“新建實驗"并進入實驗設置界面。
選擇反應板類型：選擇96孔板、384孔板或其他適合實驗需求的板型。
選擇熒光染料/探針：根據所使用的實驗體系，選擇適合的熒光通道和染料類型（如SYBR Green、TaqMan探針等）。QS12K支持最多6個熒光通道，因此可以進行多重PCR實驗。
3.2 設置熱循環程序
熱啟動：根據所用的DNA聚合酶和試劑的要求，設置熱啟動步驟。通常在反應的初期進行熱啟動，以確保DNA聚合酶激活并減少非特異性擴增。
擴增程序：設置合適的PCR擴增循環程序，通常包括：
變性步驟：通常在95°C下進行約15秒，目的是分開DNA雙鏈。
退火步驟：根據引物的退火溫度（Tm值）設置退火溫度，通常在55-65°C范圍內，持續20-30秒。
延伸步驟：在72°C下進行，通常每個循環延伸時間為30秒到1分鐘，具體時間取決于擴增片段的大小。
3.3 數據采集
在每個擴增循環的延伸階段或退火階段結束時進行熒光數據采集。設置合適的熒光檢測時間點，確保信號的準確捕捉。
3.4 啟動實驗
完成所有設置后，確認無誤后點擊“開始實驗"按鈕，啟動實時PCR實驗。
4. 實驗過程中監測
在實驗進行過程中，QuantStudio 12K Flex PCR儀會實時顯示PCR擴增曲線、熒光信號強度變化等數據。用戶可以通過設備的顯示界面實時監控實驗進度。
擴增曲線：隨著PCR反應的進行，熒光信號會逐漸增強，用戶可以看到擴增曲線的變化。在適當的時間點，熒光信號超過背景信號時，稱為“閾值周期"（Ct值）。Ct值的大小與初始模板的數量成反比。
反應板監控：如果使用多孔板，可以查看每個孔的實時擴增曲線，方便了解每個樣品的反應情況。
5. 數據分析與結果
5.1 Ct值的確定
通過實時熒光信號的監測，可以獲得每個樣品的Ct值。Ct值代表熒光信號達到閾值時的循環數，是反應效率的一個重要指標。
低Ct值表示樣品中目標DNA的初始量較高。
高Ct值表示樣品中目標DNA的初始量較低。
5.2 數據導出與分析
完成實驗后，用戶可以通過設備的分析軟件導出數據并生成實驗報告。QuantStudio 12K Flex PCR儀支持多種數據分析功能，如：
標準曲線分析：根據標準品的Ct值與已知濃度構建標準曲線，計算樣品中目標基因的拷貝數。
相對定量分析：使用2-ΔΔCt方法進行相對定量分析，比較不同樣本間目標基因的表達量。
多重PCR分析：如果進行多重PCR實驗，可以同時分析多個目標基因的表達或檢測多個突變。
5.3 報告生成
分析完畢后，用戶可以生成實驗報告，報告包括各個樣品的Ct值、擴增曲線、標準曲線、相對定量數據等內容。
6. 注意事項與故障排除
6.1 常見問題
擴增失敗或Ct值異常高：可能由于模板DNA濃度過低、引物設計不當、PCR反應體系問題等導致。檢查樣品質量和反應體系，必要時優化引物設計。
非特異性擴增：出現非特異性擴增可能是由于引物退火溫度設置不合適。可以通過提高退火溫度來提高特異性。
熒光信號不穩定：檢查熒光染料的濃度是否合適，避免反應液中有氣泡，氣泡可能導致信號的偏差。
6.2 清潔與維護
定期清潔PCR儀器，保持熒光檢測窗口的清潔，避免灰塵或污染影響熒光信號的準確性。
7. 總結
QuantStudio 12K Flex實時熒光定量PCR儀具有高度的靈活性和高通量能力，適合多種分子生物學實驗的需求。通過合適的實驗設計、反應體系優化和數據分析，能夠獲得準確、可靠的實驗結果。在使用時，確保設備、試劑、樣品和程序設置的正確性，以獲得實驗效果。
