蛋白磷酸化怎么檢測(cè)檢測(cè)技術(shù)服務(wù)詳情介紹

蛋白磷酸化（Protein Phosphorylation）是生物體內(nèi)zuì為常見(jiàn)也是研究zuì為廣泛的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾。其原理是在蛋白激酶的催化作用下，將一個(gè)ATP或GTP的γ位磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上，這一過(guò)程影響了人類細(xì)胞中超過(guò)1/3的蛋白質(zhì)的功能。

圖1 蛋白磷酸化示意圖

蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化這一可逆過(guò)程幾乎調(diào)節(jié)著包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)活動(dòng)、肌肉收縮及腫瘤發(fā)生等過(guò)程在內(nèi)的所有生命活動(dòng)。因此，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)顯得尤為重要，常見(jiàn)的蛋白磷酸化修飾檢測(cè)方法有以下幾種：

1、32P 同位素放射性標(biāo)記法

32P放射標(biāo)記法是zuì經(jīng)典的磷酸化蛋白檢測(cè)方法，主要是通過(guò)純化激酶及［γ－32P］進(jìn)行體外標(biāo)記，或利用［γ－32P］－ATP或32PO43－（正磷酸鹽）平衡胞內(nèi)的ATP水平進(jìn)行體內(nèi)標(biāo)記，然后通過(guò)一維或二維凝膠電泳（1-或 2-DE）等分離技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，zuì后用放射自顯影或磷儲(chǔ)屏檢測(cè)磷酸化蛋白。

2、蛋白免疫印跡法（Western Blot）

蛋白質(zhì)樣品通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，在膠面上會(huì)形成按分子量大小排列的清晰條帶。隨后將這些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF（聚偏氟乙烯膜）或NC膜（硝酸纖維素膜）上，與特異性磷酸化抗體結(jié)合，再用酶或同位素標(biāo)記的二抗檢測(cè)，通過(guò)顯色或自顯影觀察磷酸化蛋白。

3、熒光染色法

Pro-Q Diamond 是一種專門(mén)標(biāo)記磷酸化蛋白的熒光染料。通過(guò)熒光掃描儀檢測(cè)可以直接顯示出一維或二維凝膠電泳膠上分離的磷酸化蛋白，對(duì)非磷酸化蛋白的反應(yīng)性很低。熒光強(qiáng)度會(huì)隨著蛋白磷酸化程度的不同而呈現(xiàn)出一定的量的變化。該染料可以與其它檢測(cè)總蛋白的熒光染料配合使用，同時(shí)展示出膠上的總蛋白譜和磷酸蛋白譜。

4、流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)采用熒光標(biāo)記的單細(xì)胞懸液為檢測(cè)樣品，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記熒光的熒光強(qiáng)度來(lái)確定所檢測(cè)細(xì)胞或細(xì)胞因子的濃度。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)熒光標(biāo)記的磷酸化蛋白特異性抗體可以jīngquè測(cè)量單細(xì)胞內(nèi)的多參數(shù)磷酸化，可以同時(shí)在不同的細(xì)胞亞群中分析幾種信號(hào)通路組成元件，大大提高了工作量。

5、質(zhì)譜法

質(zhì)譜法原理是將蛋白多肽離子化，因質(zhì)荷比不同，多肽在進(jìn)入分析器時(shí)發(fā)生分離，通過(guò)測(cè)量分離肽段離子的相關(guān)參數(shù)，運(yùn)用軟件實(shí)現(xiàn)蛋白鑒定及功能分析。磷酸化蛋白肽段常不穩(wěn)定，在質(zhì)譜中會(huì)由于自發(fā)亞穩(wěn)態(tài)分解或碰撞誘導(dǎo)裂解。利用磷酸酯酶處理后，磷酸化肽段易于丟失 H3PO4 或 HPO3，磷酸化sīānsuān或sūānsuān質(zhì)量數(shù)丟失98 u，而磷酸化làoānsuān由于磷酸基團(tuán)連接在苯環(huán)上只丟失80 u。質(zhì)譜利用這些特征可以對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行鑒定。

6、Bio-Plex 懸液芯片

Bio-Plex 懸液芯片系統(tǒng)是美國(guó)伯樂(lè)公司開(kāi)發(fā)提供的一個(gè)功能強(qiáng)大的芯片技術(shù)平臺(tái)，該技術(shù)整合了軟件包、系統(tǒng)校檢工具、微球體偶聯(lián)試劑和即用型細(xì)胞因子與磷酸化蛋白測(cè)試試劑盒，可在單個(gè)樣品中同時(shí)分析多種生物分子，包括酶底物、受體、抗原或者抗體。經(jīng)過(guò)懸液芯片多重檢測(cè)獲得的數(shù)據(jù)，更有助于從整體揭示生命分子間的相互關(guān)系及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

表1不同蛋白磷酸化檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比

鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合物樣品中相關(guān)蛋白磷酸化修飾是蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)重要部分，目前已經(jīng)有多種蛋白磷酸化分析方法，它們各有優(yōu)缺點(diǎn)，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選用。百泰派克生物科技使用Thermo公司zuì新推出的Obitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀結(jié)合Nano-LC，為廣大科研工作者提供蛋白質(zhì)磷酸化檢測(cè)一站式服務(wù)，只需要將您的需求告訴我們并寄送樣品，百泰派克生物科技負(fù)責(zé)項(xiàng)目所有后續(xù)，包括蛋白提取、蛋白酶切、磷酸化或糖基化肽段富集、肽段分離、質(zhì)譜分析、質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)分析、生物信息學(xué)分析所有事宜，并為您提供詳細(xì)的中英文雙語(yǔ)版技術(shù)報(bào)告，歡迎免費(fèi)咨詢。

百泰派克生物科技--生物制品表征，多組學(xué)生物質(zhì)譜檢測(cè)優(yōu)質(zhì)服務(wù)商

北京百泰派克生物科技有限公司（Beijing Bio-Tech Pack Technology Company Ltd. 簡(jiǎn)稱BTP）從事以生物質(zhì)譜為依托的生物藥物表征，大分子物質(zhì)（包括蛋白質(zhì)、多肽、代謝物）質(zhì)譜分析以及小分子物質(zhì)檢測(cè)服務(wù)。 1、公司采用ISO9001質(zhì)量控制體系，zhuānyè提供以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的CRO檢測(cè)分析服務(wù)； 2、獲國(guó)家CNAS實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可，為客戶提供符合全球藥政法規(guī)的藥物質(zhì)量研究服務(wù)； 3、業(yè)務(wù)范圍覆蓋蛋白質(zhì)組學(xué)、多肽組學(xué)、代謝組學(xué)、生物藥物表征、單細(xì)胞分析、單細(xì)胞質(zhì)譜流式、生信云分析以及多組學(xué)生物質(zhì)譜整合分析等； 4、7大質(zhì)量控制檢測(cè)平臺(tái)，滿足您一站式服務(wù)需求； 5、服務(wù)3000+企業(yè)，10000+客戶的選擇； 6、致力于為您提供優(yōu)質(zhì)的生物質(zhì)譜分析服務(wù)!

蛋白磷酸化怎么檢測(cè)檢測(cè)技術(shù)服務(wù)詳情介紹