引言：
農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是植物基因工程中重要的載體工具，其感受態細胞的制備質量直接影響外源基因的轉化效率。本文將詳細介紹農桿菌感受態細胞的標準化制備流程，結合實驗優化技巧與注意事項，助您提升轉化成功率，滿足科研與產業化需求。
一、什么是農桿菌感受態細胞？
感受態細胞指通過物理或化學處理使細菌處于易于吸收外源DNA的狀態。農桿菌感受態細胞的制備是植物轉基因實驗的關鍵步驟，直接影響Ti質粒的轉化效率。目前主流方法為CaCl?化學法，具有成本低、操作簡便的優勢。
二、實驗材料準備
菌株選擇：常用EHA105、GV3101等致病性缺失型農桿菌
培養基：YEB液體培養基（配方：5g/L牛肉膏，1g/L酵母提取物，5g/L蛋白胨，5g/L蔗糖，0.5g/L MgSO?·7H?O，pH7.0）
試劑：無菌0.1M CaCl?溶液、液氮、50%甘油
設備：超凈工作臺、離心機、恒溫搖床、-80℃冰箱
三、分步制備流程（含關鍵參數）
步驟1：菌種活化與擴增
取-80℃保存的農桿菌劃線接種于YEB固體培養基，28℃倒置培養48小時
挑取單菌落接種至5mL YEB液體培養基，28℃、200rpm振蕩培養16-18小時
優化提示：OD???達0.4-0.6時菌體處于對數生長期，此時收獲細胞活性最佳
步驟2：菌體收集與預冷處理
將菌液轉移至預冷的50mL離心管，冰浴10分鐘
4℃、5000g離心10分鐘，棄上清
加入10mL預冷0.1M CaCl?溶液，輕柔重懸菌體
冰浴30分鐘，再次4℃離心10分鐘
關鍵點：全程保持低溫（0-4℃），防止菌膜結構受損
步驟3：感受態細胞制備
棄上清，加入2mL預冷0.1M CaCl?溶液（含15%甘油）
輕柔吹打重懸，分裝至1.5mL離心管（每管100μL）
液氮速凍1分鐘后轉入-80℃長期保存
配方優化：添加終濃度10mM MgCl?可提升DNA結合效率
相關閱讀推薦：《簡石農桿菌感受態細胞如何》
4
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務