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Elabscience乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性比色法測試盒(E-BC-K771-M)可用于以乳酸脫氫酶(LDH)釋放為指標的細胞毒性檢測。

檢測原理：

乳酸脫氫酶催化乳酸和 NAD+反應產生丙酮酸和 NADH，NADH在PMS作用下，將電子傳遞給 WST-8，產生黃色的產物，其在450 nm有特征吸收峰，從而可以通過比色法來定量乳酸脫氫酶的活性。

操作步驟：

樣本處理：

① 96 孔細胞培養板根據以下分類加樣(每一種分類至少三個復孔)：

空白孔：100 μL 無細胞的培養液(推薦使用含 1%血清的低血清或無血

清培養液)；

樣本對照孔：100 μL 待檢測細胞(約含 5000-10000 個細胞)；

最大酶活對照孔：100 μL 待檢測細胞(約含 5000-10000 個細胞)；

樣本測定孔：100 μL 待檢測細胞(約含 5000-10000 個細胞)；

② 將 96 孔細胞培養板置于 37°C，含 5% CO2空氣及 100%濕度的細胞培養箱中培養 24h。

③ 向步驟②中的空白孔，樣本對照孔中分別加入 10μL 的培養液向步驟②中的樣本測定孔中加入 10 μL 不同濃度的藥物刺激。

④ 37°C，含 5% CO2 空氣及 100%濕度的細胞培養箱中培養(根據不同實驗細胞需求選擇適當的孵育條件和時間)。

⑤ 在結束培養前 1h 從細胞培養箱中取出 96 孔細胞培養板，在最大酶活對照孔中加入 10 μL 的試劑一，并反復吹打混勻；

⑥ 37°C，含 5%CO2空氣及 100%濕度的細胞培養箱中繼續培養 1 h；

⑦ 將 96 孔細胞培養板用酶標板離心機 400 x g 離心 5 min，吸取上清液待測。

注：若無酶標板離心機，可將細胞液用移液槍吸打均勻后，移取至離心

管中，使用普通離心機離心

樣本檢測：

① 取 96 孔酶標板，按上述細胞培養過程劃分為空白孔、樣本對照孔、最大酶活對照孔和樣本測定孔，然后向各孔中加入50μL對應的待測上清液。

② 向步驟①酶標板各孔中加入50μL反應工作液，酶標儀震板5 s混勻。

③ 37°C，孵育10 min；(反應時間可根據顯色深淺延長或縮短，建議測定多個不同時間點的OD值，以便于篩選，盡量控制樣品對照孔的OD值小于0.8，最大酶活對照孔的OD值小于 2.0)。

④ 向步驟③中各孔加入 20μL試劑五，混勻，終止反應。

⑤ 酶標儀上450 nm 波長處測定各孔OD值，并設定600 nm參比波長，扣除參比波長的OD值，為所需有效吸光度值

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