亞鐵氧化酶（Hephaestin,HP）試劑盒說明書
微量法100管/48樣
注 意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
Hephaestin (HP)作為銅藍蛋白的同系物,是近年來發現的鐵轉運蛋白亞鐵氧化酶，HP屬亞鐵氧化酶家族成員,具有亞鐵氧化酶的活性,參與體內鐵代謝。HP的表達可受鐵、銅及鋅等金屬離子的調節。HP催化Fe2+氧化生成Fe3+，在介導鐵的跨膜轉運中有重要作用。
測定原理：
HP催化Fe2+氧化為Fe3+，Fe2+和ferrozine反應顯色，在560 nm下有特征吸光值。通過測定Fe2+的減少速率可測得亞鐵氧化酶的活性。
自備用品：
酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體60 mL×1瓶，4℃保存;
試劑二：液體1.5 mL×1瓶，4℃保存;
試劑三：液體11 mL×1瓶，4℃避光保存。
粗酶液提取：
按照組織質量（g）：水（mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL蒸餾水），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟：
1. 酶標儀預熱30 min以上，調節波長至560 nm。
2. 在96孔板中加入下列試劑
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 |
試劑一 | 50 | 50 |
試劑二 | 10 | 10 |
樣本 | 10 | 10 |
蒸餾水 | 30 | 30 |
試劑三 | 混勻，40℃靜置30 min | 100 |
試劑三 | 100 | |
混勻，立即測定A對照和A測定，ΔA=A對照-A測定。(每個測定管需設一個對照管) | ||
HP活性計算:
標準曲線：y = 8.2135x - 0.0006，R2 = 0.9998；(x為標準品濃度，μmol/mL；y為吸光值ΔA)
（1）按樣本質量計算
單位定義：每g樣本每分鐘氧化1nmol Fe2+定義為一個酶活力單位。
HP（nmol/min/g 鮮重）=（△A+0.0006）÷ 8.2135×V總÷T ÷(W× V樣÷V樣總)× 1000
= 40.58×（△A+0.0006）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每mg蛋白每分鐘氧化1nmol Fe2+定義為一個酶活力單位。
HP（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0006）÷ 8.2135×V總÷T ÷（Cpr×V樣）
= 40.58×（△A+0.0006）÷Cpr
V總：反應體系體積，0.1 mL；V樣：加入樣本體積0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，30min；W：樣品質量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；1000，μmol到nmol的轉換系數。
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