脫氫酶（dehydrogenase, DHA）試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
脫氫酶(dehydrogenase, DHA) 是一類催化物質氧化還原反應的酶，催化底物通過細胞色素系統被氧化，釋放的能量供機體使用，是生物體取得能量的一種方式。
測定原理：
在細胞呼吸過程中，氫受體2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC）在脫氫酶作用下接受氫以后，被還原為三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone, TF），TF呈現紅色，于485nm測定其吸光值，即得脫氫酶活性。
自備實驗儀器及用品：
篩子、天平、恒溫培養箱或水浴鍋、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、冰、蒸餾水、甲醇（不允許快遞，請用戶自備）。
試劑的組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存
試劑一：粉劑×1瓶，使用前加10mL試劑二溶解，4℃避光保存（盡量現配現用）。
試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：甲醇，自備。
樣品處理：
1. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
2. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心20min。
3. 液體：直接檢測。
測定步驟和操作表：
空白管 | 測定管 | |
樣品（μL） | 100 | |
蒸餾水（μL） | 100 | |
試劑一（μL） | 100 | |
試劑二（μL） | 100 | |
充分混勻，37℃培養24h | ||
試劑三（μL） | 900 | 900 |
振蕩1h，8000g，25℃，離心5min，取200μL上清于微量石英比色皿/96孔板，測定A485，△A=A測定-A空白管。空白管只要做一管。 | ||
脫氫酶活力計算：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線：y = 0.0422x - 0.0312；R2 = 0.9988；x為標準品濃度（μg/mL），y為吸光值。
1.按照蛋白濃度計算
酶活單位定義：在37℃時，每mg蛋白樣品每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。
DHA（μg/ min / mg prot）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷（Cpr×V樣）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷Cpr
2．按照樣本質量計算
酶活單位定義：在37℃時，每克樣品每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。
DHA（μg/ min /g 鮮重）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷W
3. 按液體體積計算
酶活單位定義：在37℃時，每mL樣本每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。
DHA（μg/ min /mL）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷V樣÷T= 0.181×（△A+0.0312）
V反總：反應總體積，1.1mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.1mL；T：培養時間，1d=1440min；W：樣品質量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL。
b. 用96孔板測定的計算公式如下
標準曲線：y = 0.0211x - 0.0312；R2 = 0.9988；x為標準品濃度（μg/mL），y為吸光值。
1.按照蛋白濃度計算
酶活單位定義：在37℃時，每mg蛋白樣品每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。
DHA（μg/ min / mg prot）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反總÷（Cpr×V樣）÷T= 0.362×（△A+0.0312）÷Cpr
2．按照樣本質量計算
酶活單位定義：在37℃時，每克樣品每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。
DHA（μg/ min /g 鮮重）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T= 0.362×（△A+0.0312）÷W
3. 按液體體積計算
酶活單位定義：在37℃時，每mL樣本每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。
DHA（μg/ min /mL）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反總÷V樣÷T= 0.362×（△A+0.0312）
V反總：反應總體積，1.1mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.1mL；T：培養時間，1d=1440min；W：樣品質量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL。
注意事項：
配制好的試劑一避光保存于4℃，最好在一周內使用，若出現紅色，則不能使用。
4
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務