單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性測定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
MDHAR 催化 MDHA 還原生成 AsA，在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。
測定原理：
MDHAR 催化 NADH 還原 MDHA 生成 AsA 和 NAD+，NADH 在 340 nm 有特征吸收峰，但是 NAD+沒有。通過測定 340 nm 光吸收下降速率，來計算出 MDHAR 活性。
實驗中所需儀器及設備：
研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、可調式移液槍和雙蒸水
試劑組成和配置：
試劑一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：液體 20mL×1 瓶，室溫保存。
試劑三：粉劑×1 瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入 3 mL 蒸餾水充分溶解。
試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 2.5 mL 蒸餾水充分溶解。
試劑五：液體 15μL×1 瓶，4℃保存。臨用前加 3 mL 試劑二充分溶解。
粗酶液提取：
1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。
2. . 細菌、真菌：按照細胞數量（104 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建
議 500 萬細胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；8000g ，4℃離心 20min，取上清液置冰上混勻待測。
3. 血清等液體：直接測定。
MDHAR 測定操作：
1. 分光光度計/酶標儀預熱 30 min，調節波長到 340 nm，蒸餾水調零。
2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預熱 30 min。
3.依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 試劑三、20μL 試劑四、20μL 試劑五和 120μL 試劑二，最后加入 20μL 上清液，迅速混勻后于 340nm 比色，記錄 30s 和 150s 的吸光值 30s
和 150s 的吸光值 A1 和 A2，△A=A1-A2。
MDHAR 活性計算公式：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×109]÷（Cpr×V 樣）÷T
= 804×△A ÷Cpr
(2). 按樣本質量計算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1U。 MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×109]÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T
= 804×△A ÷W
（3）按細胞數量計算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每 104 個細胞每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。
MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷（細胞數量×V 樣÷V 樣總）÷T = 804×△A ÷ 細胞數量
（4）按液體體積計算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷V 樣）÷T
= 804×△A
ε：NADH 摩爾消光系數，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應體系總體積，0.2mL=2×10-4L；V 樣：加入反應體系中上清液體積，20μL=0.02mL；V 樣總：提取液體積，
1 mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質濃度需要另外測定，建議使用本公司蛋白質含量 BCA 試劑盒；W ：樣品質量；T：反應時間，2min。
b.使用 96 孔板測定的計算公式如下：
(1). 按蛋白濃度計算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×109]÷（Cpr×V 樣）÷T
= 1608×△A ÷Cpr
(2). 按樣本質量計算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1U。 MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×109]÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T
= 1608×△A ÷W
（3）按細胞數量計算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每 104 個細胞每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷（細胞數量×V 樣÷V 樣總）÷T
= 1608×△A ÷ 細胞數量
（4）按液體體積計算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷V 樣）÷T
=1608×△A
ε：NADH 摩爾消光系數，6220 L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 反總：反應體系總體積，0.2mL=2×10-4L；V 樣：加入反應體系中上清液體積，20μL=0.02mL；V 樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質濃度需要另外測定，建議使用本公司蛋白質含量 BCA 試劑盒；W ：樣品質量；T：反應時間，2min。
注意事項：
臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存，3 天內使用完。
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