Highly efficient transgene-free targeted mutagenesis and single-stranded oligodeoxynucleotide-mediated precise knock-in in the industrial microalga Euglena gracilis using Cas9 ribonucleoproteins

利用Cas9核糖核酸蛋白在工業微藻中實現高效無轉基因靶向誘變和單鏈寡脫氧核苷酸介導的精確敲入

2019 年 5 月 26 日，在Plant Biotechnology Journal 雜志發表了一篇論文" Highly efficient transgene-free targeted mutagenesis and single-stranded oligodeoxynucleotide-mediated precise knock-in in the industrial microalga Euglena gracilis using Cas9 ribonucleoproteins  "，文章中將CRISPR/ Cas9系統的基因編輯技術應用于纖細裸藻中，為闡明其他微藻類的基因功能提供了一個突破。

纖細裸藻是一種單細胞光合鞭毛蟲，也是一種工業開發的微藻，它富含營養元素，積累大量的裸藻淀粉，具有多種生物活性功能。因此，大量培養的纖細裸藻是功能性食品、飼料和化妝品的商業來源。此外，在厭氧條件下，裸藻淀粉可被降解并轉化為主要由肉豆蔻酸和肉豆蔻醇組成的蠟酯。由于纖細裸藻產生的蠟酯很容易轉化為具有低冰點的生物燃料，因此它適合作為生物噴氣燃料的來源。

纖細裸藻（又名小眼蟲，Euglena  gracils）

在文章中，研究者為了在纖細裸藻中建立了一種基于Cas9核糖核酸蛋白（RNPs）的無轉基因誘變方法，在纖細裸藻葡聚糖合成酶2（EgGSL2）基因的第二個外顯子內設計了兩個靶序列，他們推測該基因可能參與了裸藻淀粉的生物合成。使用NEPA GENE電轉儀將Cas9核糖核酸蛋白導入到纖細裸藻細胞中（圖1b）。實驗結果表明，這兩種以EgGSL2為靶點的RNPs可以使纖細裸藻細胞表現出更少但更大的裸澡淀粉顆粒。靶1和靶2表型改變的平均頻率分別為71.3%和80.6%(圖1d)，并且在電穿孔后72h檢測，插入缺失突變率分別為77.7-86.8%和88.8-90.1%（圖1g）。

纖細裸藻作為一種可再生資源具有很多優異特性，但想要建立其有效靶向誘變一直是一個長期的挑戰。在這里，研究者利用CAS9 RNPS開發了一種高效的無轉基因靶向誘變和單鏈寡核苷酸介導的基因敲入，這將為纖細裸藻是一種可編輯基因組的有機體提供了第一個證據，利用裸藻中所含的副淀粉和脂肪酸合成了生物塑料，為纖細裸藻開發應用開拓了新方向，同時促進生物材料生產的可持續性發展。

文章采用的是NEPA21 電轉染儀來進行電轉，采用全新的四步法電轉程序，配合多脈沖、電壓衰減（Voltage Decay）和輔助基因導入模式設計，可在獲得高轉染效率的同時，提高細胞存活率 ，并且不需要特殊轉染試劑輔助。