用人結腸癌細胞為免疫原，免疫小鼠，制得鼠抗人結腸癌細胞表面抗原（Ag）的單克隆抗體 IgG（第一抗體），二者可以發生特異性的抗原抗體反應，形成抗原抗體復合物，再加入市售（也可自制）的熒光標記的羊抗鼠IgG抗體（第二抗體），可以與復合物進一步發生抗原抗體反應（二次抗體反應），這樣就可以在光顯微鏡下觀察到這種抗原在結腸癌細胞表面的存在。

材料與儀器

HeLa細胞
1640培養液小牛血清甲醛固定液 PBS 液體石蠟
蓋片載片培養瓶培養皿濾紙鑷子吸管倒置顯微鏡熒光顯微鏡微量加樣器

步驟

1. 將培養瓶中的結腸癌細胞接種到裝有蓋片的培養皿中，培養2~3天。

2. 在倒置鏡下觀察到蓋片上的細胞生長狀態良好后，在蓋片左上角用玻璃筆做一下標記，以免在以后的操作中正反面顛倒。

3. 將蓋片放在甲醛固定液中，4℃固定5~10分鐘。

4. 用PBS洗三次，注意不要將PBS液直接倒在蓋片的細胞面，以免引起細胞大量丟失。用濾紙片將蓋片上的PBS輕輕吸干，不要損傷細胞層。

5. 將已稀釋好的小鼠抗體滴在蓋片上．每個蓋片50 ul，37℃溫育30分鐘。

6. 用PBS洗三次，濾紙吸干。

7. 將已稀釋好的熒光標記羊抗鼠二次抗體5ul滴加在蓋片上，37℃溫育30分鐘。

8. 用PBS洗三次，濾紙吸干。

9. 將載片上滴一滴液體石蠟。然后將蓋片細胞面朝下放到載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察。

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免疫熒光抗體法

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