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二抗用于多種免疫測定中，以檢測一抗的存在。這些抗體與酶、生物分子或熒光染料偶聯，以便檢測一抗。與一抗不同，二抗針對一抗的物種和同種型產生，并通過在多個位點與一抗結合來檢測一抗。

要成功選擇二抗，應考慮以下因素：

確保良好匹配 – 宿主物種是產生二抗的動物，應始終與一抗的宿主不同。例如，如果您使用在兔子中產生的一抗，您將需要在兔子以外的其他物種（如山羊、驢或小鼠）中產生的抗兔二抗（圖 1）。

圖 1：二抗機制。

完整的抗體還是片段？ – 實際上，真正的問題是“您的一抗是單克隆還是多克隆？這兩個問題的答案通常取決于應用程序。單克隆一抗包含免疫球蛋白的單一同種型。因此，使用特異性識別該同種型的二抗至關重要。此外，單克隆抗體通常在小鼠、兔子和大鼠中產生。因此，如果一抗是小鼠 IgG1，您將需要抗小鼠 IgG 或特異性較低的 F（ab） 片段抗小鼠 IgG。抗體片段適合免疫組化和免疫熒光，因為它們體積較小且能夠穿透組織。然而，較小的尺寸可能會限制與片段偶聯的染料或酶的選擇，從而導致二抗的靈敏度可能不如全抗體選擇。

多克隆一抗包含免疫球蛋白 G 的幾種同種型的混合物。因此，為了最大限度地檢測靶標，最好使用可識別所有同種型的二抗。多克隆抗體通常在兔、山羊、綿羊和驢中以全抗體形式（重鏈 + 輕鏈）飼養，因此必須用來自不同物種的 IgG 庫對二級宿主物種進行免疫，從而使純化的二抗能夠識別所有形式。例如，如果一抗多克隆抗體是山羊 IgG，則需要抗山羊 IgG （H+L）。然而，全抗體會導致高背景和低特異性，因為輕鏈由所有免疫球蛋白共享，這會增加交叉反應性（圖 2）。

圖 2：免疫測定中全 IgG 二抗與片段化二抗的結合機制。

根據您的應用選擇偶聯物 - 這取決于二抗如何檢測信號。例如，免疫組織化學、ELISA 和蛋白質印跡應用使用基于生物素標記的比色和化學發光檢測來放大信號并提高靈敏度，以及與辣根過氧化物酶 （HRP） 或堿性磷酸酶 （AP） 起作用的酶促反應。然而，對于免疫標記、熒光顯微鏡和流式細胞術實驗，使用熒光染料（如 Alexa Fluor）檢測信號，這些染料直接與抗體偶聯以放大信號和靈敏度。

親和純化抗體與交叉吸附抗體 – 此步驟用于提高抗體的特異性，并且可以在親和純化和交叉吸附方面進行區分。大多數二抗通過親和層析進行純化，從而產生高親和力抗體。這種抗體通常用于 IHC，因為它們提供最小的非特異性結合，也可用于 western blot 以檢測低豐度蛋白質。交叉吸附的二抗通常會經過額外的純化步驟，以過濾掉與脫靶免疫球蛋白種類結合的成員。此步驟增加了它們的特異性并降低了非特異性背景。這些抗體專為免疫組織化學等特定應用而設計。