為了使用熒光標記物獲得最佳結果，必須考慮幾個因素。
首先，這是激發光源：為了減少樣品自發熒光可能產生的干擾，激發波長優選在550 nm甚至600 nm以上。除了減少背景之外，紅色光譜范圍在處理活細胞時也具有優勢，因為可以減少損傷。
其次，熒光標記應在激發波長下具有強吸收以及高熒光量子產率。消光系數和熒光量子產率的乘積通常稱為染料的“亮度"。
染料的熒光效率在光譜的藍色和綠色區域最高。在某些情況下，量子產率幾乎達到100%的理論極限。對于更長的波長，發射的量子產率急劇下降，尤其是在水溶液中。然而， ATTO-TEC已成功開發出即使在 650 nm 下也具有高量子產率的熒光標記。例如，ATTO 647N在水溶液中發出的熒光強度是舊花青染料 Cy5 ™的兩倍。ATTO 647N和 Cy5 ™的相對熒光強度。PBS 水溶液1 cm 池中相應吸收最大值處的吸光度為 0.04。22 °C 時兩個吸收光譜（相同吸收）交叉處的熒光激發。
最后，標記物的發射光譜應與所用濾光片組的傳輸相匹配。反過來，必須選擇濾光片組，使其阻擋樣品散射的激發光并允許熒光盡可能有效地通過。
當使用波長為 635 nm 的二極管激光器作為激發源以及在 650 nm 至 750 nm 之間具有高透射率的濾光片組時，例如ATTO 647N將是一個非常好的選擇。從ATTO染料列表可以看出， ATTO647N635 nm處具有高消光系數，接近吸收曲線最大值的波長，以及優異的熒光量子產率（η fl = 65%）。
下表概述了一些常用的激勵源和推薦的ATTO標簽。
| 光源 | 發射線 | 適用染料 |
|---|---|---|
| 水銀蒸氣燈 | 365納米 405納米 436 納米 546納米 577納米 | ATTO 390 ATTO 425、ATTO 430LS ATTO 425、ATTO 430LS、ATTO 465 ATTO 550、ATTO 565 ATTO Rho12、ATTO Rho101、ATTO 590 ATTO Rho13、ATTO 594、ATTO 610、ATTO Rho14 |
| 氬離子激光器 | 488nm 514nm | ATTO 488、ATTO 490LS ATTO 514、ATTO 520 ATTO 514、ATTO 490LS、ATTO 520 ATTO 532、ATTO 542 |
| Nd:YAG 激光器， 倍頻 | 532納米 | ATTO 532、ATTO Rho6G、ATTO 542 ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho11、ATTO Rho12 |
| 氦氖激光器 | 633納米 | ATTO 643、ATTO 633、ATTO 647、 ATTO 647 N、ATTO 655 |
| 氪離子激光器 | 647nm 676nm | ATTO 643 ATTO 647、ATTO 647 N、ATTO 655、 ATTO Oxa12、ATTO 665、ATTO 680 ATTO 680、ATTO 700、ATTO 725、ATTO 740 |
| 二極管激光器 | 635納米 | ATTO 633、ATTO 643、ATTO 647、 ATTO 647 N、ATTO 655 |
熒光標記物的特性
然而，應該注意的是，除了已經討論的光學考慮因素之外，選擇標記時其他因素也很重要，例如染料的 pH 依賴性光學和化學特性、其溶解度、光和化學特性穩定性、發色團的大小或連接體的長度等，其涉及或滿足各自應用的要求。這些特性與染料作為熒光標記物的適用性非常相關。
最重要的是，染料在照射過程中保持完整。許多常見的標記，例如熒光素衍生物 FITC，具有非常低的光穩定性。因此，當長時間觀察過程時，使用高強度激光激發時成像的靈敏度和質量會受到限制。這對于顯微鏡和其他基于共焦原理的技術（例如單細胞的檢測）來說是一個嚴重的缺點。與一些常用的舊染料相比，新型ATTO標簽的設計即使在長時間暴露后也顯著更加穩定。
ATTO 655與傳統 Cy5的光穩定性比較TM在水里。使用 250 W 鹵鎢燈照射，聚焦到 1 cm 池中。消光與照射持續時間。
許多常見的熒光標記物即使在沒有照射的情況下（即在黑暗中）也會分解，特別是當暴露于實驗室大氣中的低濃度臭氧時。在相同的臭氧暴露條件下，染料ATTO 647N和ATTO 655的穩定性比花青染料 Cy5 TM和 Alexa647 TM長 100 倍。這在微陣列應用中非常重要，因為染料分子位于表面，因此直接暴露在大氣中。
緊湊而強大的激光二極管現在覆蓋了光譜的整個可見光和近紅外部分。它們已作為非常有效的激發源進入許多應用/設備，并越來越多地取代傳統光源。
如果沒有最大吸收與現有激發源的波長完*對應的標記，則應選擇波長稍長的染料。吸收會稍微降低，但激發波長和熒光光譜之間的較大差異（與激發波長無關）具有在檢測過程中更好地分離散射激發光的優點。
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