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橙汁中抗壞血酸、檸檬 酸和苯甲酸的分析
閱讀：1091 發布時間：2022-9-19摘要：食品添加劑，如抗氧化劑和防腐劑的添加，可以延長食品的保質期。在本文中，我們描述了一種定量分析橙汁中抗氧化劑和防腐劑（檸檬酸、苯甲酸）的方法。該方法的開發是通過采用配備 Agilent Poroshell EC-C18 色譜柱的 Agilent 1260 Infi nity LC 系統來實現的。對樣品分析進行部分方法學驗證，證明其線性、穩定性，以及峰面積和保留時間的精密度符合要求。該方法中苯甲酸的檢測限為 0.2 µg/mL。在樣品回收率的研究中，所有化合物的回收率都大于 90%。該方法通過采用 Agilent 1290 Infi nity LC 系統可有效地轉換成一個快速的超高效液相色譜（UHPLC）方法。新方法分析速度比原方法快5 倍，并且苯甲酸的檢測限不變。兩種方法都能被食品制造商有效采用，實現對食品添加劑的質量控制。
引言抗氧化劑，如抗壞血酸的抗氧化作用是通過減少環境中的氧來實現的。抗壞血酸優先被氧化并生成去氫抗壞血酸（DHA），從而防止了基質的氧化。防腐劑，如檸檬酸或苯甲酸防止或抑制食品中微生物的生長。在一些水果中天然含有抗壞血酸、檸檬酸和苯甲酸[1]，額外添加這些成分可延長果汁的保質期。雖然果汁中苯甲酸的含量法規限值為 400 µg/mL 到 600 µg/mL，但我們更加關注的是由苯甲酸和抗壞血酸在一定條件下反應生成的致癌物質苯[2,3]。據報道，抗壞血酸的含量隨時間、溫度和其他因素變化而減少并最終生成 DHA。AOAC 方法 967.22 中檢測分析含量的方法是首先氧化抗壞血酸生成 DHA，然后再進行衍生和熒光檢測。對于 UV 分析，DHA 在波長 220 nm 以上紫外吸收很小，而抗壞血酸在 244–265 nm 波長處有紫外吸收（取決于緩沖液的 pH值[5]）。AOAC 方法 994.11 采用 UV 檢測分析橙汁中的苯甲酸。本文運用簡單的樣品提取步驟并采用 UV 檢測器對抗壞血酸、檸檬酸和苯甲酸進行定量分析。
試劑和化學品所有試劑和溶劑均為 HPLC 級。高純水由 Milli Q 水凈化系統制備（Millipore Elix 10，美國）。梯度使用的乙腈購自 Lab-Scan 公司（泰國），磷酸二氫鉀購自 Fluka公司（德國）。磷酸購自 Fluka 公司（瑞士）。抗壞血酸、檸檬酸和苯甲酸標準品均購自 Sigma-Aldrich 公司（印度）。購買在印度生產的國際品牌橙汁。
實驗部分儀器及軟件Agilent 1260 Infi nity 二元液相色譜系統由以下幾個模塊組成：• Agilent 1260 Infi nity 二元泵（G1312B）• Agilent 1260 Infi nity 自動進樣器和恒溫器（G1367E, G1330B）• Agilent 1260 Infi nity 柱溫箱（G1316A）• Agilent 1260 Infi nity 二極管陣列檢測器 （G4212B）配備 10 mm 最大光強流通池采用 Agilent 1290 Infi nity LC 系統實現了UHPLC 分析的開發和運行。該系統由以下幾個模塊組成：• Agilent 1290 Infi nity 二元泵（G4220A）• Agilent 1290 Infi nity 自動進樣器和恒溫器（G4226A, G1330B）• Agilent 1290 Infi nity 柱溫箱（G1316C）• Agilent 1290 Infi nity 二極管陣列檢測器（G4212A）配備 10 mm 最大光強流通池色譜柱：• Agilent Poroshell 120 EC-C18,4.6×100 mm，2.7 µm （部件號697975-302）工作站軟件：• B.04.02 版 Agilent ChemStation 工作站
色譜參數反相液相色譜法和 UHPLC 法的色譜參數見表 1。標準品制備準確稱取抗壞血酸、檸檬酸和苯甲酸，用流動相 A 分別配制濃度為 5000 µg/mL（ppm）、50000 ppm 和 100 ppm 標準儲備液。超聲 10 min 使苯甲酸溶解*。用流動相 A 依次稀釋上述三種標準儲備液配制成線性濃度水平的標準溶液，見表 2。pH 值 2.5 的流動相A能防止抗壞血酸的電離。樣品制備將適量的磷酸滴加到 5 mL 橙汁中，調節其 pH 值到 2.5 并渦旋混合。樣品溶液在1897×g 離心力下離心 5 min，通過 0.2 µm安 捷 倫 再 生 纖 維 素 濾 膜 過 濾（部 件 號5185-5830）。過濾后的樣品溶液直接用于樣品分析。步驟5 µL 流動相 A 作為空白進樣分析，每個線性濃度水平重復分析六次。每個濃度水平的峰面積和保留時間的數據被用于計算相對標準偏差（RSD）。根據苯甲酸低線性濃度進樣計算其檢測限（LOD）和定量限（LOQ）。確定線性濃度之前，進樣分析萃取后的橙汁樣品以測定其中抗壞血酸、檸檬酸和苯甲酸的大致濃度。以每個線性濃度水平的平均峰面積對溶液濃度作圖得線性曲線
進行回收率實驗時，將橙汁的 pH 值調節到 2.5。添加高濃度和低濃度的檸檬酸和苯甲酸到橙汁中，配制成高濃度和低濃度的加標樣品。高濃度和低濃度加標樣品的差異用于回收率計算。為評價該方法的耐用性，改變了四個關鍵的方法參數——流速 ± 2%、TCC 溫度± 5%、進樣量 ± 5% 和波長 ± 3%。針對每一個變動，重復進樣分析濃度分別為 108 ppm、7000 ppm 和 5 ppm 的檸檬酸和苯甲酸混合加標樣品七次。分析了三種不同品牌橙汁中該三種酸性物質的含量。隨后將該方法成功轉換成一個 UHPLC 方法。評估每個標準品的 LOD、LOQ 和線性，同時用峰面積和保留時間的 RSD 驗證該方法的精密度。
結果與討論分離與檢測采用多種色譜柱分離檢測檸檬酸和苯甲酸。標準品用流動相 A 溶解，同時添加標準品到橙汁中，配制成加標樣品用以測試基質干擾。安捷倫苯基-己基柱和 Poroshell EC-C18 色譜柱對水溶性標準品具有良好的分離性能。Agilent Poroshell EC-C18 色譜柱被用于進一步實驗。在一個低的 TCC 溫度和60% 甲醇 – 40% 乙腈的流動相 B 下，標準品峰與基質峰實現了良好的分離。pH 值 2.5 時，游離型抗壞血酸在波長243.5 nm 處具有最大的紫外吸收。在這個波長下基質吸收較少，所以能簡單地定量分析抗壞血酸。在波長 210.0 nm 處檢測檸檬酸，而在波長 230.0 nm 處檢測苯甲酸。因為抗壞血酸在低溫下穩定，所以在整個分析過程中，自動進樣器溫度一直恒定在 4 °C。Margolis 等人[6] 報道指出當抗壞血酸儲存在自動進樣器樣品瓶中 22h 后，其濃度會顯著下降。結果顯示，在不同批次的自動進樣器樣品瓶中抗壞血酸的濃度損失可高達 89%。然而，Margolis 的研究表明樣品瓶在經過酸堿清洗后，抗壞血酸的最大損失只有 4%。
在本研究中，測試了三種不同的樣品瓶：• MS 校驗樣品瓶 （p/n 5190-2280）• ALS 樣品瓶 （p/n 5182-0716）• 經酸堿清洗的 ALS 樣品瓶校準標準品儲存于緩沖溶液中，并放置于4 °C 的 ALS 恒溫箱中，16h 后在所有三種樣品瓶的樣品中，抗壞血酸的峰面積損失為 3%，而檸檬酸和苯甲酸的峰面積損失均小于 1%。本研究表明這三種樣品瓶都可以用于本分析。在本應用報告中，使用的是 MS 校驗樣品瓶。圖1展示了采用Agilent 1260 Infi nity LC 系統分離抗壞血酸、檸檬酸和苯甲酸的色譜圖。一步升至25% 流動相 B 的梯度程序對于從基質中洗脫出苯甲酸峰非常必要。維持高比例的有機相 13 min 以上，可確保*去除來自橙汁的基質峰。
