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采用陰離子交換色譜法對蛋白質進行分析-四元液相色譜系統
閱讀：1994 發布時間：2022-9-5摘要：在本應用簡報中，我們展示了利用陰離子交換色譜法，在使用四種不同的高鹽洗脫緩沖液（最大濃度為 2 M）進行線性和階梯梯度洗脫條件下，對四種蛋白質進行分離的相關信息。Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統的流路設計中未采用鐵/鋼質材料，因此可耐受生物分析和生物純化應用中的嚴苛條件，從而保持其出色的 UHPLC 性能。使用四種鹽（氯化鈉 (2 M)、(1 M)、乙酸鈉 (1 M) 和四甲基氯化銨 (1 M)）進行線性梯度洗脫時，均可獲得保留時間和峰面積精確度。此外，使用 2 M 氯化鈉作為洗脫緩沖液時，結果表明保留時間和分離度可保持穩定達 48 小時以上。在此類條件下，采用不銹鋼材質的液相色譜系統會面臨一些問題，例如鹽引起的腐蝕，因此需要執行特殊的、繁雜的清洗步驟。使用 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統則可以*避免此類清洗步驟，從而提高生物分析或生物純化應用的通量和效率。
前言在諸如離子交換 (IEX) 或體積排阻色譜(SEC) 法中使用的高鹽流動相，對于不銹鋼材質的液相色譜系統而言是一項嚴峻挑戰。由于長期使用含鹽緩沖液所引發的腐蝕效應，導致此類液相色譜系統存在損壞的風險。其結果就是需要執行繁雜的清洗步驟。因此，強烈建議使用不含鐵的系統，避免受到高鹽濃度的影響。Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統在樣品流路中不含金屬成分。自動進樣器、柱溫箱和檢測器流路中所有的毛細管和接頭均*是不含金屬的，因此，生物分子只與陶瓷或 PEEK 管線接觸。這使得用戶可以使用高鹽含量的緩沖液。此外，相對于 Agilent 1260 Infinity 液相色譜系統而言，該系統可在較寬的 pH 范圍（1-13，短時間分析可以高達 14）內保持穩定1。在本應用簡報中，以陰離子交換色譜 (AEX)為例，論證了將 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統用于高鹽應用的可行性。利用陰離子交換色譜 (AEX) 對四種蛋白質混合物進行分離，其中使用了四種不同的洗脫鹽：氯化鈉 (2 M NaCl)、 (1 M KCl)、乙酸鈉 (1 M CH3COONa)和四甲基氯化銨 (1 M [(CH3)4N]Cl)。在線性和階梯梯度條件下，分別分析了保留時間和峰面積的精確度。此外，還使用 2 MNaCl 洗脫緩沖液考察了保留時間和峰面積的長時間穩定性（48 小時）。
實驗部分Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統，包括以下模塊：• Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元泵(G5611A)• Agilent 1260 Infinity 高效生物惰性自動進樣器 (G5667A)• Agilent 1260 Infinity DAD VL（G1315D，配置生物惰性標準流通池，10 mm）• Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C)色譜柱Agilent Bio WAX，NP5，4.6 × 250 mm，PK 色譜柱軟件Agilent OpenLAB CDS ChemStation，LC和 LC & MS 系統版，修訂版 C.01.02 [14]溶劑緩沖液 A： 20 mM Tris，pH 7.6緩沖液 B： 20 mM Tris，pH 7.6 +• 2 M NaCl• 1 M KCl• 1 M CH3COONa• 1 M [(CH3)4N]Cl所有試劑均為液相色譜級。新制超純水產自配置 0.22 µm 膜式終端過濾器 (Millipak)的 Milli-Q Integral 水純化系統。Tris 購自Fluka 公司（西格瑪奧德里奇，美國圣路易斯）。NaCl 購自 VWR 公司（美國賓夕法尼亞州拉德諾）。[(CH3)4N]Cl 和 KCl 購自 Merck KGaA 公司（德國達姆斯塔特）。CH3COONa 購自 J.T. Baker 公司（VWR，美國賓夕法尼亞州拉德諾）。
柱塞桿密封墊清洗液• 100% 超純水• 每 1.5 min 清洗 0.3 min蛋白質• 取自馬骨骼肌的肌紅蛋白，17053 Da，pI 6.9 (1 mg/mL)• 取自雞蛋清的伴清蛋白，76000 Da，pI 6.24 及 6.092 (2 mg/mL)• 取自牛奶的 a-乳清蛋白，14175 Da，pI 4.5 (1 mg/mL)• 取自大豆的胰蛋白酶抑制劑，20100 Da，pI 4.5 (1 mg/mL)所有蛋白質均購自西格瑪奧德里奇公司（美國圣路易斯）。
結果和討論線性梯度陰離子交換色譜，使用 2 M NaCl利用 AEX 在線性梯度條件下，對四種蛋白質的混合物進行了分離，緩沖液 B 中使用 2 M NaCl 作為洗脫鹽。圖 1 中所示為線性梯度條件下蛋白質的分離色譜圖。蛋白質的洗脫順序主要與其等電點 (pI) 有關。其中 a-乳清蛋白及胰蛋白酶抑制劑的分離與蛋白表面的電荷變化有關，其未必與總凈電荷相等。七次運行后測定其保留時間和峰面積相對標準偏差，即為精確度。伴清蛋白中存在不同的異構體，具體取決于其結合鐵的量2。因此，選取五個色譜峰對保留時間精確度進行評估。相反的是，伴清蛋白色譜峰不能用于計算峰面積 RSD，原因在于其異構體未能實現基線分離。所有五個色譜峰的保留時間 RSD均小于 0.09 %。所評估蛋白質的峰面積RSD 均小于 1.1%。
陰離子交換色譜，使用不同類型的鹽分離度和選擇性受洗脫離子，即鹽類型改變的影響3。根據所分析蛋白質的不同，鹽可能會對蛋白質洗脫產生不同的色譜影響。為了找到針對具體應用的最佳洗脫離子，可以對多種鹽進行測試。如果在一個序列中需要測試多于三種鹽類型，那么在方法開發過程中最好選用溶劑選擇閥。在本應用簡報中，在洗脫緩沖液中評估了四種鹽。圖 2、3 和 4 中所示為線性梯度條件下蛋白質的分離結果，分別采用 1 M KCl（圖 2）、1 M CH3COONa（圖 3）和 1 M[(CH3)4N]Cl（圖 4）作為洗脫鹽。并計算了保留時間和峰面積的 RSD，其中 n = 7。
實驗證實保留時間、分離度以及峰形和強度的變化與所使用的洗脫鹽有關。特別是，伴清蛋白 A 和 B 的分離度在使用不同鹽類型時也不同，其中使用 1 M CH3COONa時的分離度最佳。考慮到上述所有因素（最佳分離度、最佳峰形和最高強度），且使基線較為平直，則 1 M KCl 是分離四種蛋白質的選擇。
階梯梯度使用階梯梯度（特別是只有一種蛋白質需要分離時）可以加速分離過程，從而降低緩沖液的消耗量。圖 5 和 6 中所示為階梯梯度下的蛋白質分離，分別使用了 1 MKCl（圖 5）和 1 M CH3COONa（圖 6）。并計算了保留時間和峰面積的 RSD，其中n = 7。由于 AEX 色譜柱所需的平衡時間較長，與線性梯度相比，階梯梯度的保留時間和峰面積精密度略差。此外，在梯度階梯的時間點可觀察到負峰，同樣是由于平衡時間不足引起的。
為了證明在使用高鹽緩沖液條件下保留時間和分離度的長期穩定性，以 2 M NaCl作為洗脫鹽對蛋白質分離的情況（線性梯度）進行了長達 48 小時的監測，請參見圖 7 和 8。結果證實在整個時間段內，保留時間和分離度均保持穩定。在所有測試中，柱塞桿密封墊清洗液（含有 100%水）每 1.5 分鐘啟用一次，清洗 0.3 分鐘，以去除泵柱塞桿上的鹽
結論本應用簡報論證了 Agilent 1260 Infinity生物惰性四元液相色譜系統是高鹽應用的理想選擇。通過采用陰離子交換色譜法對四種不同蛋白質進行分離，使用四種不同的洗脫離子/鹽類型在線性梯度條件下均可獲得較高的精確度。根據所使用的鹽類型，色譜圖中的保留時間、分離度、峰形和強度隨之變化。因此，我們建議測試不同的鹽類型，找到最適宜的一種以實現最佳的樣品分離。如果需要測試多于三種鹽類型，那么在方法開發過程中最好選用溶劑選擇閥。當使用 2 M NaCl 作為蛋白質分析的洗脫鹽時，結果證實保留時間和分離度可在超過 48 小時的時間內保持穩定。采用階梯梯度可縮短分離時間，并降低緩沖液消耗。但是，需要考慮的是色譜柱需要更長的平衡時間。因此，強烈建議在每次分析之間留有足夠的平衡時間，不論使用的是線性還是階梯梯度。另外一個要點是定期（例如，每 1.5 分鐘清洗 0.3 分鐘）進行密封墊清洗（含有 100% 水），以去除泵柱塞桿上的鹽。在高鹽應用中，Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統和 Agilent BioWAX，NP5，4.6 x 250 mm，PK 色譜柱均表現出了保留時間和分離度穩定性