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紫外-可見分光光度計可方法測定蔗糖中的總亞硫酸鹽 (SO2)
閱讀：2559 發布時間：2022-6-22前言：藥物制劑中添加藥物賦形劑不是因為其具有治療活性，而是為了優化生產過程，幫助提高制劑穩定性或生物利用度，并提高患者的可接受性[1]。蔗糖 (C12H22O11) 是制藥行業中常用的甜味劑，常用于掩蓋口服藥物令人不快的味道，充當防腐劑，以及提高液體藥物的粘度。為確保藥物制劑中使用的蔗糖的安全性和質量，需要對雜質進行準確測定。亞硫酸鹽是蔗糖中常見的雜質。美國藥典方法 USP43-NF38-6076[2] 介紹了一種使用紫外-可見分光光度法測定蔗糖中總亞硫酸鹽含量的酶解方法。在本研究中，我們將展示 Agilent Cary 3500 紫外-可見分光光度計在根據 USP 方法測定蔗糖中總亞硫酸鹽方面的優勢。
實驗部分背景USP43-NF38-6076 方法的原理是，在有氧條件下，亞硫酸鹽被亞硫酸鹽氧化酶氧化，生成硫酸鹽和過氧化氫，如下面的反應方程式所示。（亞硫酸鹽氧化酶）SO32– + O2 + H2O SO42– + H2O2 (1)然后，在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 的存在下，生成的過氧化氫被煙酰胺腺嘌呤二核苷酸過氧化物酶（NADH 過氧化物酶）還原，如下面的方程式 2 所示。（NADH 過氧化物酶）H2O2 + NADH + H+ 2H2O + NAD+ (2)反應中生成的 NAD+ 的量與樣品中亞硫酸鹽的含量成正比。通過測量 340 nm 處的吸光度可以確定 NADH 的消耗量。通過計算空白和樣品反應前后的吸光度差值 (A1–A2) 可以確定總亞硫酸鹽濃度。A1 為酶解反應開始時的吸光度。A2 為酶解反應結束時的吸光度。為了獲得 ?A亞硫酸鹽，用樣品的吸光度差(A1–A2) 減去空白的吸光度差 (A1–A2)。根據下面的公式，可以計算亞硫酸鹽濃度（以 SO2 計）[g/L]：C(總 so2) = V × Mol.Wt × ?A亞硫酸鹽 (3) ε × d × v其中：V = 最終體積 [mL]Mol.Wt = SO2 的分子量 [g/mol]ε = NADH 在 340 nm 處的消光系數 = 6300[l × mol–1 × cm–1]d = 光程 [cm]v = 樣品體積 [mL]
實驗部分樣品前處理樣品 1 和樣品 2 溶液：將 2.0 g 蔗糖（Sigma Aldrich，CAS 號57-50-1）溶于 5.0 mL 蒸餾水中，得到最終濃度為 400 mg/mL的樣品 1。使用 2.0 g 市售蔗糖（購自當地超市），重復上述流程制備得到樣品 2。亞硫酸鹽標準溶液 (80 ppm SO2)：將 157.5 mg 無水亞硫酸鈉溶于 1.0 L 蒸餾水中，得到最終濃度 0.1575 mg/mL。參比溶液：將 4.0 g 蔗糖（Sigma Aldrich，CAS 號 57-50-1）溶于 5.0 mL 蒸餾水中。加入 0.5 mL 上述亞硫酸鹽標準溶液，然后用蒸餾水將所得溶液稀釋至 10.0 mL。標準溶液：將 1.0 g 檸檬酸加入 1.0 L 容量瓶中，并用 1.0 L 蒸餾水溶解。然后，準確稱取 800 mg 無水亞硫酸鈉（Merck，CAS 號 7757-83-7）并加入溶液中（最終濃度約 400 mg/L，以 SO2 計）。用適量的 1 g/L 檸檬酸溶液稀釋儲備液，配制多個濃度的亞硫酸鹽標準溶液（0–400 mg/L，表 1）。
7 個標樣各自的濃度如表 1 所示。使用可選的 A g i l e n tOpenLab 軟件和儀器隨附的 Cary 紫外工作站軟件進行檢測。OpenLab 提供了有助于滿足 21 CFR Part 11 和附錄 11 數據可靠性要求的工具。這些工具包括針對每次更改的可供檢索的審計追蹤。
結果與討論根據 USP 方法定量分析蔗糖樣品中的總亞硫酸鹽為了根據 USP43-NF38 專論方法測定蔗糖中的總亞硫酸鹽含量 (SO2)，應在反應開始 (A1) 和結束 (A2) 時記錄約 340 nm 處出現的最大吸光度。然后從這些值中扣除空白溶液獲得的相應值。樣品溶液的吸光度差 (A1–A2) 不應超過參比溶液吸光度差的一半。使用 Agilent Cary 3500 紫外-可見分光光度計測得的蔗糖樣品 1和樣品 2 的 ?A亞硫酸鹽分別為 0.0023 Abs 和 0.0044 Abs（表 5）。兩個樣品的 ?A亞硫酸鹽均小于參比的一半，并且在 USP 規定的可接受范圍內。結果表明，Cary 3500 適用于蔗糖中亞硫酸鹽雜質的測定。
標準溶液中總亞硫酸鹽的定量分析Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計可同步測量 8 個樣品池位置（7 個樣品和 1 個參比）。通過在反應開始前、反應過程中和反應結束后，在 300–400 nm 波長范圍內進行 12 次掃描，在相同條件下同時監測 7 個標樣（圖 2）。同時測量多個樣品/標樣的功能消除了環境和操作人員造成的分析誤差以及由此帶來的數據準確性風險。Cary 紫外工作站動力學應用程序使分析人員可以選擇不連續的波長或特定波長范圍進行掃描。使用 Cary 紫外工作站動力學應用程序同時測量 7 個標樣各自的吸光度 (A1)。其方式為測量 300–400 nm 范圍內的吸光度4 分鐘（12 次掃描）。然后，使用移液器將 20 µL 亞硫酸鹽氧化酶懸液依次加入每個標樣中并混合。使用動力學應用程序，通過 45 分鐘內 340 nm 處降低的吸光度來監測 NADH 的消耗。在反應結束時，使用表 3 中用于測量吸光度 (A1) 的相同參數（參數 2）測量標準溶液的吸光度 (A2)。使用導出到 MSExcel 的數據，按照公式 3 計算總亞硫酸鹽 (SO2)。結果匯總于表 6 中。
監測 NADH 隨時間的消耗情況Cary 紫外工作站動力學應用程序用于監測添加亞硫酸鹽氧化酶后 NADH 的消耗情況。儀器同時測量 7 個標樣，監測 45 分鐘內每個標樣在 340 nm 處的吸光度（圖 3）。與每個標樣單獨測量，總測量時間需要 5 多個小時相比，這種方法可節省大量的時間。Cary 3500 具有高數據采集速率（多達 250 個數據點/秒）和寬光度測量范圍，不含活動部件。這些功能可確保在所有測量類型下均可采集準確的數據。
結論Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計能夠在單次實驗中同步監測 7 個標樣中 NADH 的消耗情況。與單獨測量每個標樣相比，這種方法可節省 5 個多小時的測量時間。同步測量還意味著 7 個標樣均在相同的條件下進行檢測，從而消除了任何測量變量（例如環境溫度的變化）。根據 USP43-NF38 方法測定了蔗糖中的總亞硫酸鹽含量。同步測量多個樣品能夠盡可能減少環境、操作人員和儀器引入的誤差，提高數據質量。可選的 Agilent OpenLab 軟件用于支持數據采集過程的 Part 11/附錄 11 合規性。Cary 3500 可通過軟件控制的攪拌功能在整個測量期間混合樣品池中的所有反應物。