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摘要：本研究中開發出了一種用于尿液中香草苦杏仁酸 (VMA)、高香草酸 (HVA) 和 5-羥基吲哚 乙酸 (5-HIAA) 定量分析的高靈敏度、高特異性 LC/MS/MS 方法。這一分析方法采用簡 單稀釋作為樣品前處理過程即可達到所需功能靈敏度，同時還能夠對相當寬動態范圍內 的分析物進行定量分析。所有化合物均表現出良好的重現性 (CV < 6%)，此外所有校準曲 線都具有線性 (R2 > 0.9998)。

前言：液相色譜/三重四極桿質譜儀 (LC/MS/MS) 非常適用于多種分析物的快速分析。本研究開 發出了一種用于尿液中 VMA、HVA 和 5-HIAA（圖 1）同時測定的簡單樣品前處理稀釋流程。 將不同濃度的每種分析物加標至潔凈尿液中制得校準物。色譜系統中包括五氟苯基 (PFP) 色 譜柱以及甲醇與含 0.2% 甲酸的水組成的流動相。研究中對定量和定性 MRM 離子對進行監 測，并加入了每種分析物的氘代內標以確保定量分析的準確性與重現性。

實驗部分 液相色譜方法 液相色譜系統由 Agilent 1290 Infinity LC 二 元泵、配備恒溫箱的孔板進樣器以及柱溫箱 組成。如果使用的液相色譜系統具有不同的 延遲體積，則可能需要調節并驗證梯度以使 色譜分析結果具有可重現性。

質譜方法 Agilent MS/MS 系統由采用安捷倫噴射流 技術的 Agilent 6460 三重四極桿 LC/MS 和 Agilent MassHunter 軟件 B.06.00 組成。 化學品與試劑 校準物和內標均購自 Cerilliant (Round Rock, TX)。DC Mass Spect Gold 尿液 MSG5000 購自 Golden West Biologicals (Temecula, CA)。Lyphocheck 376 和 377 對照品購自 Bio-Rad 以及 Burdick & Jackson。LC/MS 級甲醇購自 VWR。質譜分析用甲酸購自 Sigma-Aldrich 公司 (St. Louis, MO)。 樣品前處理 通過將每種分析物加標至 DC Mass Spect Gold 尿液中制得標準校準物。通過連續稀 釋 DC Mass Spect Gold 尿液來獲得其余 標準校準物濃度。使用含內標的 0.2% 甲 酸水溶液將校準物、對照品和尿樣稀釋十 倍。樣品應經過離心和/或過濾后再進樣至 LC/MS/MS 系統中。 數據分析 Agilent MassHunter 定量分析軟件 (B.06.00) 用于進行數據分析。在校準曲線的線性回歸 中采用 1/x 作為加權因子。在 MassHunter 定量軟件中，利用色譜峰面積與已知濃度內 標的峰面積之比進行定量。

結果與討論：采用安捷倫五氟苯基 (PFP) 色譜柱實現了所有分析物的色譜分離（圖 2）。對尿液中存 在的 HVA 與 5-HIAA 干擾進行分離顯得尤 為重要。如果不根據保留時間進行適當分離， 這些化合物將相互干擾，導致不準確的定量 結果。 為研究基質效應，將 10 種不同濃度的所有 分析物加標至含 0.2% 甲酸的水中。另一組 樣品將分析物加入空白尿液中，制備方法與 上述相同。研究中利用內標溶液對所有混合 物進行稀釋后對其進行分析。隨后根據計算 得知，兩種溶液中每種分析物的峰面積比均 介于 91% - 93% 之間（表 2）。而使用內標 峰面積比校正計算濃度時，則得到了出色校 正結果，結果介于 93% - 115% 之間（表 2）。 這一結果確認了內標對偏差進行了校正。 分別于連續三天以及一天中三次制備校準標 樣和 Bio-Rad Lyphocheck 對照品，以便確 定日內和日間的精密度和準確度。三種分 析物的日內和日間準確度均在 10% 內，且 線性范圍內所有濃度的變異系數均小于 6% （表 3 和表 4）。該分析方法在濃度為 0.078 - 100 mg/L 的測定范圍內具有出色的線性， R2 值均大于 0.9998（圖 3）。

結論 本研究開發了一種用于定量尿液中香草苦杏 仁酸 (VMA)、高香草酸 (HVA) 和 5-羥基吲哚 乙酸 (5-HIAA) 的分析方法。該方法通過簡單 的稀釋步驟實現了全部三種分析物的同時測 定，具有出色的回收率、重現性和準確性。