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多中心切割二維液相色譜在雜質分析方法開發中的應用
閱讀：1676 發布時間：2021-11-1摘要：在藥物和精細化學品的開發和生產過程中，雜質分析非常重要。本應用簡報 表明多中心切割二維液相色譜非常適用于藥物和精細化學品雜質分析的方法 開發。使用 Agilent 1290 Infinity 二維液相色譜解決方案，經第一維分離后 所檢測到的每一個峰都被中心切割并轉移到具有不同選擇性的第二維進行進 一步分離。此方法能發現可能存在的共洗脫化合物。此外，通過向樣品添加 疑似雜質還可確證對雜質的鑒別。
前言 實驗部分 在制藥和化工行業中，藥物和精細化 學品的雜質分析具有重要意義。對于 新原料藥，ICH 指南 Q3A (R2) 規定 含量大于或等于 0.05% 的雜質必須報 告，含量大于等于 0.1% 的雜質必須 鑒定1 。 藥物和精細化學品的雜質分析可通過 液相色譜分析該物質的濃縮溶液來實 現。藥物或精細化學品中的雜質通常 與主要化合物結構相似，且相互間結 構也相似。因此，使用具有給定選擇 性的系統（色譜柱-溶劑組合）可能無 法實現分離。該問題的一個解決方案 是將共洗脫化合物中心切割并轉移到 具有不同選擇性的分離系統，從而實 現分離。使用 Agilent 1290 Infinity 二維液相色譜解決方案的多中心切割二 維液相色譜，對與主要化合物共洗脫 的雜質的分離分析能力如之前的應用 簡報2 所述。 在雜質分析方法開發期間，必須檢測 所有雜質，不能有任何雜質因與主要 化合物或其他雜質共洗脫而被隱藏。 采用中心切割二維液相色譜可確保做 到這一點。1290 Infinity 二維液相色 譜解決方案可實現第一維分離的多個 峰的中心切割，然后將這些中心切割 儲存在定量環中并對儲存的中心切割 依次進行第二維分析。 本應用簡報展示了一個代表藥物化合 物的樣品的多中心切割二維液相色譜 分析。對第一維分離后所測到的每一 個峰均進行中心切割，然后在具有不 同選擇性的第二維中進行分離分析， 從而發現第一維分離中可能存在的共 洗脫物。
儀器 用于多中心切割的 Agilent 1290 Infinity 二維液相色譜解決方案包括以 下模塊： • Agilent 1290 Infinity 二元泵 （G4220A，2 臺） • Agilent 1290 Infinity 自動進 樣器 (G4226A)，配備 Agilent 1290 Infinity 恒溫器 (G1330B) • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C) • Agilent 1290 Infinity 閥驅動 (G1170A)，配備 2 位/4 通雙 向閥（二維液相色譜閥頭， G4236A） • Agilent 1290 Infinity 閥驅動 （G1170A，2 個），配備帶 40 µL 定量環的多中心切割閥 （G4242-64000，2 個） • Agilent 1290 Infinity 二極管陣 列檢測器（G4212A，2 個）， 配備 10 mm 最大光強卡套式流 通池 (G4212-60008) 軟件 Agilent OpenLab CDS ChemStation 版軟件，版本 C.01.07 [27] 以及 Agilent 1290 Infinity 二維液相色譜采集軟件， 版本 A.01.02 [24]
色譜柱 • 第一維：Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18, 2.1 × 150 mm, 1.8 µm（部件號 959759-902） • 第二維：Agilent Poroshell 120 Bonus-RP, 4.6 × 50 mm, 2.7 µm （部件號 699968-901）化學品 所有試劑純度均為液相色譜級。乙 腈和甲醇購自 Merck (Darmstadt, Germany)。新制超純水來自配置 0.22 µm 膜式終端過濾器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水純化系統 (Millipak, EMD Millipore, Billerica, MA, USA)。 甲酸來自安捷倫（部件號 G2453- 85060）。 樣品 使用添加了幾種雜質的 N,N-二乙基間 甲苯酰胺 (DEET) 的甲醇/水 (50/50, v/v) 溶液作為樣品，代表含有一系列 雜質的藥物。
結果與討論 在藥物或精細化學品的雜質分析方法 開發過程中出現的一個重要問題是， 使用給定的方法是否能將所有雜質與 主要化合物分離以及彼此分離，或者 是否發生共洗脫。圖 1 展示了使用 C18 柱以及水-乙腈梯度（均含 0.1% 甲酸） 的一維雜質分析。在放大的色譜圖 中，可以觀察到主要化合物與兩種雜 質發生了部分共洗脫。為了對該部分 共洗脫進行分離分析并檢查每個峰可 能出現的共洗脫，將峰進行中心切割 并轉移到具有不同選擇性的第二維進 行分離。
圖 2 中的圖 A 展示了采用中央二維液相色譜閥并流配置以及兩個多中心切 割閥的多中心切割管道圖。圖 2 中的 圖 B 展示了多中心切割閥，其預先安 裝了經過壓力測試的 40 µL 定量環。 多中心切割算法可確保最大限度減少 閥切換，并盡可能快地在第二維中分 析從第一維流出物中取出的中心切 割。對于每一次多中心切割二維液相 色譜分析，獲得的第一個中心切割在 峰駐留組件 A（圖 2A 右側的多中心 切割閥）的定量環 1 中保存。然后， 中央二維液相色譜閥切換，在第二維 中對第一個中心切割進行分析。在第 一個中心切割的第二維分析期間，可 獲得多達 5 個中心切割并在峰駐留組 件 B（圖 2A 左側的多中心切割閥） 的定量環 1 到 5 中保存，直到它們 進入第二維分析。在每個峰駐留組件 （多中心切割閥）中，始終需要一個定 量環分別用于第一維流出物和第二維 溶劑的流通。當第一個中心切割完成 第二維分析后，中央二維液相色譜閥 再次切換，多達 5 個中心切割可在峰 駐留組件 A 的定量環 1 到 5 中駐留， 而駐留在峰駐留組件 B 中的中心切割 在第二維中進行分析。當中心切割在 峰駐留組件中駐留時，在分析該駐留 組件中的中心切割之前將執行沖洗梯 度，所駐留中心切割的第二維分析將 以反向駐留順序進行。 多中心切割算法可使在第一維分析運 行的同時，開始進行中心切割的第二 維分析。這種方法意味著在同一分析 過程中可以重復使用定量環來進行中 心切割，并且可以進行比安裝的定量 環數量更多的中心切割。有關中心切 割算法、操作例程和軟件功能的更多 詳細說明，請參閱技術概述3 。
多中心切割可基于時間（中心切 割時間，例如，已知的第一維分離） 或基于峰（通過檢測第一維峰觸發 中心切割，例如，未知樣品）執行。 圖 1 為使用基于時間的多中心切割的 雜質分析。為了能發現共洗脫的樣品 組分，每種雜質都進行中心切割并在 第二維中進行分析。此外，對主要化 合物的整個峰進行三次間隔緊密的連 續中心切割。 圖 3 展示了多中心切割的方法設置。 在梯度預覽部分，可加載第一維參比 色譜圖，且可自動生成用于中心切割 的時間段。生成的時間段可以在第二 維時間段表中進行編輯，并且可以手 動添加其他中心切割以更詳細地研究 目標區域。對于雜質的中心切割，選 擇的采樣時間為 0.40 分鐘，該時間 相當于 200% 的定量環填充（40 µL 定量環體積，0.20 mL/min 第一維流 速）。由于定量環滿溢，定量環中已 全部填充為第一維流出物。梯度預覽 部分的放大視圖顯示了前四種雜質的 切割時間段。橙色區域表示采樣時 間，較暗的陰影區域預測第一維流出 物中轉移到第二維的部分。為了對主 要化合物的整個峰進行三次間隔緊密 的連續中心切割，選擇的采樣時間為 0.10 分鐘（50% 的定量環填充）。這 樣，含有主要化合物峰的第一維流出 物被全部采集而沒有任何損失
圖 4 展示了二維液相色譜中心切割查 看器中的多中心切割二維液相色譜分 析結果。上面的兩張圖為標記有中心 切割的第一維色譜圖（左）和中心切 割表（右）。底部的左側展示了由第 二維檢測器記錄的第二維色譜圖。此 處，可以追溯采用反向駐留順序和沖 洗梯度 (F) 分析的中心切割的第二維 分析順序。在底部的右側，單個第二 維色譜圖可進行顯示和疊加。 雜質中心切割的第二維分析結果如 圖 5 所示。對于中心切割 4 和 11，在 第一維中部分共洗脫的化合物，可以 在第二維中得到分離。
圖 6 展示了主要化合物整個峰的三 個間隔緊密的連續中心切割的第二維 分析結果。總體而言，第二維分析顯 示有三種雜質與主要化合物共洗脫。 一種雜質可在主要化合物的整個峰范 圍內檢測到（存在于中心切割 5 到 7 中）。第二種雜質出現在中心切割 6 和 7 中，第三種雜質在第一維中與主 要化合物部分共洗脫并在中心切割 7 中被分離。為了確定雜質身份，可以合成疑似化 合物并在雜質分析過程中將其添加到 樣品中。例如，在樣品溶液中加入雜 質，該雜質在第一維中與主要化合物 共洗脫，然后在第二維中與主要化合 物分離。圖 7 展示了樣品中添加的 雜質含量不斷增加時，樣品的分析結 果。中心切割后，可在第二維分析中 檢測到雜質的含量不斷增加。多中 心切割二維液相色譜可提供可靠定量 所需的線性和重現性，如技術概述3 所述。
結論 具有多中心切割的 Agilent 1290 Infinity二維液相色譜解決方案可實現第一維 分離的多個峰的中心切割，并將這些 切割轉移到具有不同選擇性的第二維 中進行分離。本應用簡報表明多中心 切割二維液相色譜非常適用于藥物、 精細化學品或藥物和化學品制劑的雜 質分析方法開發。將第一維分離后檢 測到的峰轉移到第二維中進行分離， 可以發現可能存在的共洗脫物。