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6470B三重四極桿LC/MS 系統對紅茶和橙子基質進行多殘留農藥分析
閱讀：1829 發布時間：2021-9-2摘要：本應用簡報介紹了一種利用 Agilent 6470B 三重四極桿 LC/MS 系統檢測食品基質中 244 種農藥殘留的 LC/MS/MS 篩查方法。有機橙子和紅茶由于所含成分復雜，因此 被選擇用于評估該方法檢測食品基質中農藥殘留的性能。在橙子基質中，除一種目 標農藥外，其余所有目標農藥均可在小于或等于歐盟委員會規定的默認最大殘留限 量 (MRL) 10 µg/kg 的水平被檢出[1]。在濃紅茶基質中，239 種農藥可在小于或等于 10 µg/kg 的濃度被檢出。研究人員還研究了基質效應對分析物響應的影響，結果表 明，橙子基質和紅茶基質中分別有 50% 和 40% 的農藥可在 SANTE 指導原則要求的 范圍內 (80%–120%) 得到回收[2]。這些結果證明，6470B 三重四極桿 LC/MS 可滿足 高靈敏度要求，能夠對食品基質中的農藥進行準確、精密地定量分析。
前言：農藥對于保護農作物起著*的作 用，在大多數農產品的生長環境中，為實 現高產量，往往需要使用農藥。因此，我 們十分關心所購買的農產品中是否存在農 藥及其含量。在如今各類有機產品和無機 產品琳瑯滿目的市場上，這一點尤其值得 關注，因為食品真偽或食品污染會影響有 機食品的質量。監管機構（例如，美國環 保局 (US-EPA)[1,3] 和歐盟委員會[4]）制定 了相應的法規來限制農藥的使用以及允許 量，從而保證消費者購買到安全的食品。 最大殘留* (MRL) 是指正確使用農藥 時（良好的農業生產方式），食品或飼 料內部或表面所含法律容許農藥殘留的高水平。在食品中，典型的 MRL 約為 µg/kg 級（十億分之一 (ppb)），因此需要 使用非常靈敏的儀器來檢測化合物。對于 紅茶等含有多種內源性組分的食品尤其如 此，因為這些內源性組分會造成嚴重基質 效應。 本應用簡報介紹了一種 LC/MS/MS 篩查 方法，該方法可對復雜多樣的食品基質 中所含的 244 種農藥進行檢測和定量。 將安捷倫農藥全套測試混標分別加入有 機紅茶提取物和全橙提取物中。提取物 按照下文所述的 Agilent QuEChERS 萃 取和 EN 分散 SPE 方案制備。將 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜與 6470B 三重四極桿 LC/MS 聯用，以動態多反應監測 (dMRM) 方法分析樣品。6470B 三重四極 桿 LC/MS 進行了多方面的硬件改進，例 如采用 VacShield 技術，離子源無需放空 即可維護，有利于延長儀器正常運行時 間；采用更快速的電子器件，具有改善的 穩定時間參數，能夠在極低的駐留時間下 保證色譜峰重現性。
實驗部分：試劑與標準品 本研究使用了安捷倫農藥全套測試混 標（部件號 5190-0551）。將農藥全套測 試混標的八種子混合物進行混合，然后 用乙腈 (ACN) 稀釋得到最終農藥工作溶 液，該溶液濃度為 10 µg/g。將該溶液 加入 QuEChERS 提取物中用于制備校準 樣品。為確定樣品基質中的方法檢測限 (MDL) 和定量下限 (LLOQ)，使用紅茶和 有機橙樣品提取物分別制備了 7 個濃度在 0.5–100 ppb 之間的校準樣品。 所有試劑和溶劑均為 HPLC 或 LC/MS 級。 乙腈和甲醇購自 Honeywell (Morristown, NJ, USA)。超純水產自配備 LC-Pak Polisher 和 0.22 µm 膜式終端過濾器濾芯的 Milli-Q Integral 系統 (EMD Millipore, Billerica, MA, USA)。甲酸和甲酸銨購自 Fluka（SigmaAldrich 公司，St. Louis, MO, USA）。
樣品前處理 有機散葉紅茶和有機橙購自當地雜貨店。 用 8 mL 水將 2 g 茶葉樣品潤濕，并使樣 品在室溫下溫育 2 小時。利用陶瓷均質子 （部件號 5982-9312）制出充分混合的均 勻橙子樣品，并稱取 10 g 樣品用于提取。 用 10 mL 乙腈通過劇烈振搖對 2 g 固體茶 樣品和 10 g 固體橙子樣品萃取 1 分鐘。 分別向各混合物中加入一袋安捷倫 EN 方 法萃取鹽（部件號 5982-6650），振搖 1 分 鐘，然后在 3000 ×g 下離心 5 分鐘。將 6 mL 茶葉上清液加入用于高色素 EN 方法 的 Agilent QuEChERS 分散 SPE 管（部件 號 5982-5356）中。同樣，將 6 mL 橙子 上清液加入用于含色素的水果和蔬菜 EN 的 Agilent QuEChERS 分散 SPE 管（部 件號 5982-5256）中。將兩者振搖 1 分 鐘，然后在 3000 ×g 下離心 5 分鐘。收 集所得上清液，并通過 0.45 µm 針頭過 濾器過濾。將之前制備的農藥工作溶液以 相對原固體食物基質干重 100 ng/g (ppb) 的濃度加入紅茶和橙子提取物中。用適當 的基質進一步稀釋樣品，獲得 0.5、1、 5、10、20、50 和 100 ppb 七個濃度水 平的農藥校準樣品，需在進樣前立即制 備，每個濃度重復進樣六次。將農藥也加 入純乙腈中，比較 10 ng/g 濃度下兩種基 質的信號回收率。
設備 使用 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜系統 進行色譜分離，該系統由以下模塊組成： • Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler， 配備樣品冷卻裝置 (G7167B, #100) • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱 (G7116B) 該液相色譜系統與配備安捷倫噴射流技術 離子源 (G1958-65638) 的 Agilent 6470B 三重四極桿 LC/MS (G6470B) 聯用。分別 使用 Agilent MassHunter 采集軟件（版 本 10.1）和 MassHunter 定量分析軟件 （版本 10.1）進行數據采集和分析。 方法 LC/MS 參數見表 1。極性、母離子和子 離子以及碰撞能量等 MRM 參數均從成熟 的現有方法中復制而來，并針對所選的弱 響應分析物優化了離子源條件。在快速極 性切換 dMRM 模式下進行數據采集。將 2 µL 最終提取物進樣至 LC/MS 系統。使 用忽略原點的線性擬合以及 1/x 加權進行 校正曲線回歸。
結果與討論 動態 MRM 方法可實現快速分離 之前使用安捷倫 LC/TQ 儀器（型號 G6470A）開發的多殘留農藥篩查方法可 直接用于 6470B 三重四極桿 LC/MS 系統 (G6470B)。之前由于液相色譜柱和液相 色譜系統不同，保留時間略有偏移，因 此使用 MassHunter 軟件的動態 MRM 更 新選項自動調整所有農藥的保留時間。 圖 1 顯示了 244 種農藥的疊加 MRM 色 譜圖，這些農藥以 1 ng/g 的濃度加標于 橙子提取物中，Y 軸放大了弱響應農藥的 信號。使用 14.5 分鐘液相色譜梯度，所 有化合物的 MRM 色譜圖都實現了基線分 離。大部分農藥的定量濃度為默認 MRL 的 10%。
標準曲線分析 在紅茶基質和橙子基質中，通過重復進 樣 (n = 6) 7 個濃度在 0.5–100 ng/g 范圍 內的校準品得到校正曲線，評估多殘留 農藥測定的精密度和準確度。結果表明 獲得了優異的分析精密度（LLOQ 及以 上濃度下的相對標準偏差 (RSD) < 20%） 和平均準確度（LLOQ 及以上濃度下的計 算濃度/預期濃度介于 80%–120% 之間）。 橙子提取物中所有 244 種農藥和紅茶提 取物中 230 種農藥（共 244 種）的校正 曲線的相關系數 (R2 ) 均大于 0.99。紅茶 中 14 種農藥的低相關系數 R2 (<0.99) 反 映出嚴重的基質效應。紅茶基質中四種代 表性農藥的校正曲線如圖 2 所示。
在本研究中，6470B 三重四極桿 LC/MS 可以檢出橙子基質中的所有農藥（信噪 比 > 3），濃度均低于 10 µg/kg，可用于 篩查方案。而紅茶基質中除了一種化合 物（啶酰菌胺）外，其余所有化合物的 殘留量均小于或等于 10 µg/kg。用校正 曲線確定基質中各農藥的 LLOQ，定義為 6 次重復進樣測得的低濃度，峰面積的 準確度介于 80%–120% 之間，RSD 小于 20%。圖 3 顯示了紅茶基質和橙子基質中 農藥化合物的 LLOQ。改進后的 6470B 三 重四極桿 LC/MS 系統可以定量紅茶和橙 子中的大多數目標農藥，濃度低于歐盟 委員會規定的默認 MRL 值 10 µg/kg[4]：紅 茶和橙子樣品中，分別有 239 種農藥（共 244 種）和 243 種農藥（共 244 種）的 LLOQ 小于或等于 10 ng/g。對于 US-EPA[3] 規定的具有特定容差的化合物，其定量濃 度均小于或等于 MRL 值。 食品基質回收率 為評估基質效應（離子抑制和增強），研 究人員在 10 µg/kg 的默認 MRL 下，比較 了基質與純溶劑中的農藥響應，并計算出 農藥回收率，如圖 4 所示。橙子基質中 大約有 50% 的化合物實現了 SANTE 指導 原則要求的 80%–120% 范圍內的回收； 紅茶基質中大約有 40% 的化合物實現了 這一范圍內的回收[2]。與預期一致，紅茶 基質相較橙子基質表現出更強的基質效 應。因此，通常建議采用基質匹配校正曲 線分析有嚴重基質效應的樣品。由基質空 白樣品的分析結果可知，雖然原始紅茶或 橙子樣品是從當地超市購買的“有機"產 品，但它們仍含有 12 種農藥。
結論 利用超高效 1290 Infinity II 液相色譜系統 與配備高靈敏度噴射流技術離子源 (AJS) 的 6470B 三重四極桿 LC/MS 聯用的 LC/MS 平臺，評估食品基質中 244 種農 藥殘留的定量性能。這套 6470B 三重四 極桿 LC/MS 系統還增加了 VacShield 和 經過改進的精密調諧的電子器件，易于維 護且性能穩定，可實現長時間運行，同時 保持穩定性和靈敏度。 本應用簡報中使用了兩種食品基質，紅茶 和橙子提取物。出人意料的是，在當地超 市購買的有機產品中也含有一些合成農 藥。與純乙腈相比，兩種食品基質的在分 析物響應方面的差異均表現出明顯的基 質效應。即使在復雜基質中，也有超過 98% 的目標農藥（共 244 種）的 LLOQ 處于或小于歐盟委員會規定的默認 MRL 值 10 µg/kg，證明該 LC/MS 平臺具有高 靈敏度。根據基質中的農藥響應與純乙腈 中的農藥響應計算化合物回收率。橙子基 質中大約有 50% 的化合物實現了 SANTE 指導原則要求的 80%–120% 范圍內的回 收；紅茶基質中大約有 40% 的化合物實 現了這一范圍內的回收。