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摘要：電荷異構(gòu)體分析是一項(xiàng)對(duì)所用液相色譜系統(tǒng)有較高要求的應(yīng)用，因?yàn)樗枰褂酶?蝕性的高濃度鹽緩沖液和非常平緩的梯度來(lái)實(shí)現(xiàn)最佳分離。使用 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)對(duì)不同的鹽梯度進(jìn)行評(píng)估，并分析分離度和重現(xiàn)性。 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)包括高速泵及其*不含鐵的流路，非常適合用于 生物色譜條件，可避免對(duì)系統(tǒng)造成潛在的腐蝕性損壞。即使對(duì)于挑戰(zhàn)性的平緩 梯度也表現(xiàn)出出色的重現(xiàn)性，證實(shí)了 1290 Infinity II 生物液相色譜儀作為新一代安捷倫液相色譜系統(tǒng)，生成的數(shù)據(jù)具有高可信度。

前言：1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)配備高 性能高速泵。與低壓混合泵（如四元泵） 相比，二元泵的主要優(yōu)勢(shì)在于，它能夠更 準(zhǔn)確、更精密地混合小比例溶劑組分。這 種精確混合能力可以在溶劑梯度開始和 結(jié)束時(shí)提供高精度的溶劑組成[4]。這是生 成可重現(xiàn)且準(zhǔn)確的平緩梯度（每個(gè)通道 低于 1%/min）的基礎(chǔ)。 1290 Infinity II 生物液相色譜是新一代安 捷倫液相色譜系統(tǒng)，專為生物色譜條 件（如 2 mol/L NaCl、高達(dá) 8 mol/L 尿素 的高鹽濃度，以及如 0.5 mol/L NaOH 或 0.5 mol/L HCl 的高/低 pH 溶劑）而設(shè)計(jì)。 整個(gè)流路*不含不銹鋼 (SST) 或鐵；貫 穿 Multisampler、高容量柱溫箱和檢測(cè)器 的所有毛細(xì)管和接頭均由 MP35N（一種鎳 鈷合金）制成。這種材料可以減少高濃度 鹽緩沖液的潛在腐蝕，避免因鐵離子存在 引起的蛋白質(zhì)修飾（如氧化、蛋白質(zhì)復(fù)合 物形成）。 本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)介紹了對(duì)曲妥珠單抗和 NISTmAb 參比標(biāo)樣的電荷異構(gòu)體的分 析。研究中測(cè)試了不同的鹽梯度斜率，以 便達(dá)到最佳分離。然后評(píng)估了最佳梯度斜 率的重現(xiàn)性。單克隆抗體 (mAbs) 是一種高度異質(zhì)性大 分子，大小約為 150 kDa，通常通過(guò)重 組法生產(chǎn)。它們的生產(chǎn)要經(jīng)歷復(fù)雜的生 物合成過(guò)程，這一過(guò)程中可發(fā)生大量修 飾，從而產(chǎn)生數(shù)百種不同的異構(gòu)體。脫 酰胺化、氧化、二硫鍵、N-糖基化、N-末 端和 C-末端加工是最常見的翻譯后修飾 (PTMs)。所有這些修飾均可在合成過(guò)程 中發(fā)生，但生產(chǎn)和儲(chǔ)存過(guò)程也會(huì)增加這些 大分子的復(fù)雜性。PTMs 會(huì)形成復(fù)雜的異 構(gòu)體分布，需要進(jìn)行全面的分析和監(jiān)測(cè)， 因?yàn)樽罱K藥品中的修飾可能與生物活性喪 失、半衰期改變或免疫原性增加相關(guān)[1]。 某些 PTMs 會(huì)導(dǎo)致分子形成電荷異構(gòu) 體，通常使用離子交換色譜 (IEX) 對(duì)這些 異構(gòu)體進(jìn)行分析[2]。電荷異構(gòu)體是最重要 的關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQAs) 之一，因此需要 嚴(yán)格的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制。確認(rèn)產(chǎn)品正 確生產(chǎn)并鑒別和定量任何雜質(zhì)至關(guān)重要。 平緩梯度洗脫在蛋白質(zhì)的 IEX 中非常常 見。用于洗脫蛋白質(zhì)的離子強(qiáng)度模式中的 典型鹽梯度約為 1–3 mmol/min，pH 值 的允許誤差為 ±0.02 個(gè) pH 單位[3]。

實(shí)驗(yàn)部分 設(shè)備 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)，包括以下模塊： • Agilent 1290 Infinity II 生物高速泵 (G7132A) • Agilent 1290 Infinity II 生物 Multisampler (G7137A)，配備樣品恒 溫箱（選件 #101） • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱 (G7116B)，配備標(biāo)準(zhǔn)流速生物兼容 性熱交換器 • Agilent 1290 Infinity II 可變波長(zhǎng)檢測(cè) 器 (G7114B)，配備生物兼容性微量 流通池，3 mm，2 µL 軟件 Agilent OpenLab CDS 2.5 版 色譜柱 Bio MAb, NP5, 2.1 × 250 mm, PEEK（部 件號(hào) 5190-2411） 化學(xué)品 所有試劑純度均為液相色譜級(jí)。新制超 純水來(lái)自配置 0.22 µm 膜式終端過(guò)濾器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水純化系統(tǒng) (Millipak, Merck-Millipore, Billerica, MA, USA)。磷酸二氫鈉一水合物、磷酸氫二 鈉七水合物、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、 三羥甲基甲胺、咪唑購(gòu)自 Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)。

樣品 • Agilent-NISTmAb（部件號(hào) 5191-5744） • 人源化單克隆抗體曲妥珠單抗（商 品名為赫賽?。┵?gòu)自 Roche (Basel, Switzerland) • 曲妥珠單抗溶于 30 mmol/L 磷酸鹽 緩沖液中，pH 6.8 緩沖液配制 配制 2 L 30 mmol/L 磷酸鹽緩沖液 (pH 6.8)：稱取 4.45 g 磷酸二氫鈉一水合 物和 7.44 g 磷酸氫二鈉七水合物加入 2 L 棕色瓶中，用超純水定容至 2 L（& 緩 沖液  A）。將 29.22 g 氯化鈉（總濃度 500 mmol/L）加入 1 L 棕色空瓶中，用配 制好的磷酸鹽緩沖液 A 定容至 1 L（& 緩 沖液 B）。測(cè)量?jī)煞N配制緩沖液的 pH 值，如有需要，將 pH 值調(diào)至 6.8（加入 大量鹽會(huì)改變 pH 值）。配制的緩沖液均 使用 0.2 µm 濾膜過(guò)濾。

方法 見表 1。 注：使用高濃度鹽溶液作為洗脫液時(shí)，需 要考慮在泵方法中設(shè)置相應(yīng)溶劑類型。 例如，對(duì)于含 500 mmol/L 氯化鈉的溶 劑 B，在泵方法的溶劑選擇字段使用“氯 化鈉 0.5 mol/L"而非一般水相或水。高濃 度鹽可改變?nèi)軇┑膲嚎s系數(shù)，因此使用預(yù) 先配置的溶劑表可以使泵達(dá)到最佳性能。

結(jié)果與討論 方法開發(fā) 為獲得所需分離度并實(shí)現(xiàn)最佳分離，電荷 異構(gòu)體分析需要進(jìn)行全面的方法開發(fā)。有 兩個(gè)參數(shù)是成功的關(guān)鍵：最佳 pH 值和最 佳梯度斜率。這兩個(gè)因素都會(huì)對(duì)分離產(chǎn) 生重大影響。首先，建議進(jìn)行 pH 篩選， 以找到用于實(shí)現(xiàn)分離的最佳 pH。在之前 的實(shí)驗(yàn)中，使用 pH 6.4–7.4 的緩沖液進(jìn) 行分析，發(fā)現(xiàn)兩種樣品（曲妥珠單抗和 NISTmAb 參比標(biāo)樣）在 pH 6.8 時(shí)均獲得 最佳結(jié)果（數(shù)據(jù)未展示）。下一步是確定 理想的梯度斜率，以實(shí)現(xiàn)有效的分離。