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摘要：目前需要通過一種超高靈敏度的定量分析方法來測定男性體內(nèi)總睪酮和游離 睪酮的濃度，尤其要能夠測定女性和兒童體內(nèi)的低濃度睪酮。因此，安捷倫 開發(fā)了一種使用 Agilent 6495 離子漏斗質(zhì)譜儀定量分析和表征血清中睪酮的 分析方法，同時確定了適合實驗室使用的分析方法。

 

前言：睪酮 (T) 是一種促進男性生殖器發(fā)育 的雄性激素，與女性的雌性激素前體 類似，它可以影響男性的第二性征。 它可以發(fā)揮同化作用，并對兩性行為 產(chǎn)生影響。循環(huán)睪酮可與性激素結(jié)合 球蛋白 (SHBG) 結(jié)合，其中小部分與白 蛋白結(jié)合，另一小部分以游離激素形 式存在。非 SHBG 結(jié)合的游離睪酮是 生物活性成分，因為與血清白蛋白結(jié) 合的睪酮可以自由離解。 實驗部分 化學(xué)品與試劑 用于基質(zhì)匹配校準物的人血清購自 Golden West Biologicals (Temecula, CA)。 標樣和內(nèi)標購自 Sigma-Aldrich (St Louis, MO)。樣品前處理和液相色譜溶劑購 自 Burdick & Jackson (Morristown, NJ)。

 

 樣品前處理 根據(jù)以下步驟配置樣品、校準物和基 質(zhì)中的質(zhì)量控制 (QC) 物質(zhì)。 1. 將 100 µL 樣品和 5 µL 5 ng/mL 內(nèi)標 置于試管中 2. 向每個試管中加入 2 mL HPLC 級的 3:2 乙酸乙酯/己烷，并渦旋混合 2 分鐘 3. 將有機層轉(zhuǎn)移至另一潔凈試管， 并加入 500 µL 0.1 mol/L NaOH 溶液 4. 在室溫下收集有機層并在氮氣下 吹干 5. 干燥后，將樣品復(fù)溶于 100 µL 70:30 的水/甲醇中進行分析數(shù)據(jù)分析 采用 Agilent MassHunter 采集軟件 (B.07) 進行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)采集。采 用 Agilent MassHunter 定量分析軟件 (B.07) 對數(shù)據(jù)進行分析。

 

結(jié)果與討論 線性 采用線性回歸擬合和 1/x 的加權(quán)因子得 到了不包括原點在內(nèi)的校準曲線，從 而確定了總睪酮在 1-1000 pg/mL 濃度范 圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù) (R2 ) 平均值大于 0.998 （圖 1）。根據(jù) 10:1 的信噪比 (S/N) 測定 得到定量限 (LOQ) 為 5 pg/mL。 準確度和精度 本研究得出了出色的結(jié)果，結(jié)果匯總 如表 1 所示。在 4 天的單次運行中， 對六種濃度的 QC 樣品進行五次分析。 表 1 顯示了每日的準確度和整體精 密度。所有 QC 樣品的準確度為 75%- 125%，精密度 < 13%。方法對比 將 LC/MS/MS 分析方法與經(jīng)過預(yù)先驗 證的 ELISA 方法相比，以確保結(jié)果的 準確性。采用 LC/MS/MS 分析方法和 ELISA 方法提取并分析二十五份機密 的患者樣品。表 2 列出了通過這兩種 方法得到的結(jié)果 (ng/dL) 和百分比差 異。如圖 2 所示，R2 > 0.96。

儀器對比 使用兩臺 Agilent 6495 三重四極桿 LC/MS 儀器分析相同樣品并對比結(jié) 果。如圖 3 所示，R2 值 > 0.96。

 

結(jié)論 這些數(shù)據(jù)表明，該提取流程和 LC/MS/MS 分析方法可用于對低濃度 總睪酮進行所需的定量分析。所購買 基質(zhì)材料中的低濃度睪酮和其他干擾 化合物成為了限制因素，阻礙了該分 析方法檢測低濃度的睪酮。校準曲線 獲得了出色的線性，并得到了高度重 現(xiàn)、準確而數(shù)據(jù)。