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使用安捷倫LC-MS/MS 對全血中的THC 和代謝物進行高效定量分析
閱讀：841 發布時間：2021-1-13摘要：復雜生物樣品的高效提取、凈化和分析對法醫學實驗室極為有益。磷脂 (PPL) 已被確定為在全血中四氫da麻酚 (THC) 及其代謝物的 LC-MS/MS 分析中引起基質效應的主要來源。本應用簡報介紹了全血中的 ?9 -THC (THC) 及其主要代謝物 11-羥基-?9 - THC (THC-OH) 和 11-nor-9-羧基-?9 -THC (THC-COOH) 的提取和 LC-MS/MS 分析。樣品前處理中采用孔內蛋白質沉淀法 (PPT) 和 Agilent Captiva EMR-Lipid 直通 1 mL 過濾柱去除 PPL。Captiva EMR-Lipid 能夠得到更潔凈的洗脫液，去除全血基質中 97% 以上不需要的 PPL，且目標分析物的回收率高于 92%。對 1 ng/mL THC、THC-OH 和 THC-COOH 的分析得到了理想的峰形，并獲得了良好的信噪比 (S/N)。在 0.5 至 100 ng/mL 范圍內獲得的響應呈線性，R2 高于 0.99。獲得的定量限在 1.0 ng/g 以下，RSD 小于 11.5%。在三天的實驗過程中，得到的結果一致。
前言：在法醫學實驗室中，LC-MS/MS 分析之前高效的樣品前處理是一個重要考慮因素。樣品前處理可用于減少系統污染并改善數據完整性、方法選擇性、分析靈敏度和可靠性。全血中存在的兩種主要干擾物為是蛋白質和磷脂 (PPL)。PPL 已被確定為 LC-MS/MS 生物分析中引起基質效應的主要來源，因為在電噴霧電離 (ESI) 期間所形成的液滴表面上會發生競爭電離1 。常用的法醫學樣品前處理技術包括蛋白質沉淀 (PPT)、固相萃取 (SPE)、液液萃取 (LLE) 和介質液液萃取 (SLE)。每種技術在速度、成本和生成數據的質量方面各有優劣。例如，PPT、 LLE 和 SLE 無法去除 PPL，而 SPE 執行起來更耗時且更復雜2 。然而，在這些技術中，PPT 得到了廣泛的認可。PPT 以規定的比例向生物樣品中加入有機沉淀溶劑（如乙腈 (ACN) 或甲醇 (MeOH)），可輕松高效地除去蛋白質。隨著蛋白質的變性，它們形成的沉淀可通過過濾或離心得以去除。但 PPT 無法去除 PPL，因為 PPL 能夠溶于有機沉淀溶劑中。大麻物質類是支持案件調查的法醫學實驗室中常見的目標分析物之一。快速、準確地確認并定量生物樣品中的 ?9 -THC (THC) 及其主要代謝物 11-羥基-?9 -THC (THC-OH) 和 11-nor9-?9 -羧基-THC (THC-COOH) 至關重要。然而，THC 及其代謝物在樣品前處理過程中容易發生非特異性結合。迫切需要一種全血樣品前處理方法，在減少樣品前處理步驟（包括離線 PPT、離心、轉移和稀釋）的同時實現簡化的孔內 PPT 和 PPL 去除。本應用簡報介紹了一種借助 Agilent Captiva EMR-Lipid 1 mL 過濾柱去除干擾物質（特別是 PPL）的方法，該方法采用簡單的直通形式，不會引起分析物損失。所得的提取物更潔凈，減少了潛在的離子抑制以及色譜柱和質譜儀污染。
依次使用孔內 PPT 和 Captiva EMR-Lipid 過濾柱去除 PPL，對全血中的 THC、THC-OH 和 THC-COOH 進行提取。隨后使用 Agilent 6490 三重四極桿液質聯用系統進行定量分析。對 PPL 去除率進行了評估。還測定了 THC 及其代謝物的日間（3 日）準確度、精密度和回收率。有關血漿樣品的分析，請參見安捷倫應用簡報使用 Captiva EMR-Lipid 和 LC-MS/MS 對人血漿中的 THC 和代謝物進行高效定量分析3 。
實驗部分：試劑與化學品 ?9 -THC、11-羥基-?9 -THC、11-nor-9-?9 -羧基-THC、?9 - THC-d3、11-羥基-?9 -THC-d3 和 11-nor-9-羧基-?9 -THC-d9 購自 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)。LC-MS/MS 級甲酸銨同樣購自 Sigma-Aldrich。所有溶劑均為液相色譜級或更高級別，均購自 Burdick and Jackson (Muskegon, MI, USA)。溶液在甲醇中配制濃度為 10 µg/mL 的 THC 及其代謝物 THC-OH 和 THC-COOH 的混標工作溶液。將氘代 THC-d3、THC-OH-d3 和 THC-COOH-d9 混合到工作溶液中，濃度為 10 µg/mL（溶于甲醇中），并用作內標 (IS)。校準標樣和質量控制樣品在預加標質量控制 (QC) 樣品中加入適當濃度的標準工作溶液，平行配制七份。QC 樣品為低濃度 QC (LQC)、中等濃度 QC (MQC) 和高濃度 QC (HQC)，分別對應于全血中 1、10、 50 ng/mL 的濃度。在每種濃度的 QC 樣品中，添加濃度為 50 ng/mL 的氘代混標溶液 (IS)。在經過 Captiva EMR-Lipid 凈化的空白基質中，用 THC 及其代謝物的工作溶液后加標，其加標濃度分別對應于全血中 1、 10、50 ng/mL 的濃度。另外，還加入一份 5 µL 的 1.0 µg/mL IS 溶液。基質匹配校準曲線由標準工作溶液制得。對經過 Captiva EMR-Lipid 凈化的空白基質進行后加標，加標濃度對應于提取物中 0.5、1、5、10、50、100 ng/mL 的濃度。在每種濃度的校準標樣中加入 5 µL 1.0 µg/mL IS。
……
結果與討論：去除不需要的脂質基體 EMR-Lipid 方法簡便，通用于極性、中等極性和非極性的目標物分析，可消除基質效應并改善分析物回收率。EMR-Lipid 利用*的吸附劑化學作用，用水活化 EMR-Lipid 吸附劑后，能通過體積排阻和疏水性相互作用選擇性捕集脂類（圖 2）。脂類上的無支鏈烴鏈進入吸附劑中，而體積較大的分析物并不進入其中。然后，進入吸附劑中的脂鏈通過疏水相互作用被捕集。PPL 是細胞膜的主要成分，大量存在于全血中。PPL 是由磷酸酯和膽堿單元組成的親水性頭部基團以及由長鏈烷基組成的疏水性尾部構成。