化工儀器網
技術文章
采用 LC/QQQ 法測定雞肉中的甲硝唑
閱讀：1026 發布時間：2020-11-18前言： 甲硝唑 (Metronidazole, MTZ) 是畜牧業生產中常用的一種硝基咪唑類藥物，具有抗厭氧菌 和抗原蟲作用，主要用于治療雞、火雞的組織滴蟲病、牛毛滴蟲病，還可與其它抗生素聯 合，用于治療厭氧菌感染。但研究表明，該物質對人體具有神經毒性和潛在致癌性。鑒于 此，歐盟和美國食品藥品監督管理局禁止在動物源性食品中使用甲硝唑等硝基咪唑類藥 物。2002 年 12 月，我國農業部修訂了《動物性食品中獸藥高殘留*》，規定可使用 甲硝唑治療動物疾病，但禁止以抗應激、提高飼料報酬、促生長為目的將該藥物用于所有 食品動物，并規定所有食品動物可食性組織中甲硝唑的高殘留*為零。為保障食品安 全，建立動物性食品中甲硝唑殘留的檢測方法勢在必行。 本研究利用 Agilent Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱凈化雞肉樣品，并使用 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜系統/ 6460 三重四極桿液質聯用系統分析樣品中的甲硝唑殘留。
甲硝唑分析 對試料進行樣品前處理。從所取全部樣品中取出可食部分約 500 g，剔除筋膜，用組織 勻漿機充分搗碎均勻，轉入潔凈容器中，密封并標記，于 –18 °C 以下冷凍存放。稱取均 質樣品 4 g（至 0.01 g）于 50 mL 具塞聚丙烯塑料離心管中，加入 40 μL 200 μg/L 同位素內標工作液（將甲硝唑13C2- 15N2 標準品溶于甲醇從而完成制備），加入 4 mL 4% 氯化鈉水溶液（分析純度），渦旋混勻，超聲處理 5 min，加入 20mL 乙酸乙酯（色譜純 度）提取，渦旋混勻，9000 r/min 4 °C 離心 5 min，取 5 mL 上清液于 40 °C 氮氣下吹 干，用 5 mL 0.1 mol/L 鹽酸溶液復溶待凈化。使用 Agilent Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱對所得樣品提取液 進行凈化和富集，具體操作如下：Plexa PCX 固相萃取柱依次 用 5 mL 甲醇和 5 mL 純水活化。將 5 mL 樣品提取液分兩次過 柱，依次用 0.1% 甲酸（色譜純度）水溶液和甲醇（色譜純度） 各 5 mL 淋洗，抽干柱子，用濾紙將柱子擦干凈，用 5 mL 5% 氨 化甲醇分兩次洗脫，收集洗脫液，40 °C 氮氣吹至近干，用 1 mL 流動相重新溶解，過 0.2 μm Agilent Captiva RC 濾膜后，供儀器 測定。 隨后，使用 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜系統/6460 三重四極 桿液質聯用系統對其中的甲硝唑殘留進行分析。液相色譜條件和 梯度程序如表 1 所示，質譜分析條件和部分質譜儀參數分別如 表 2 和表 3 所示。
本文采用同位素標記內標法定量。用甲醇溶解甲硝唑標準品， 制備得到 100 μg/L 標準工作液，并逐級稀釋、配制得到 0.1、 0.25、0.5、1.0、2.5、5、10 μg/L 系列標準溶液，并加入內標 工作液（同位素標記內標為甲硝唑13C2- 15N2），使內標濃度均為 2.0 μg/L。以標準溶液濃度為橫坐標，待測組分與內標物的峰面 積之比為縱坐標繪制標準曲線，按內標法計算樣品中甲硝唑的含 量。通過繪制曲線得到，在 0.1–10 µg/L 線性范圍內，甲硝唑的 線性相關性良好，相關系數 r > 0.995。
樣品中待測物色譜峰的保留時間與相應標準色譜峰的保留時間一 致，變化范圍應在 ±2.5% 之內。待測化合物定性離子的重構離 子色譜峰的信噪比 (S/N) ≥ 3，定量離子重構離子色譜峰的信噪 比 (S/N) ≥ 10。同一檢測批次，樣品中的兩個子離子的相對豐度 比與濃度相當的標準溶液相比，各離子對的相對豐度應與校準溶 液的相對豐度一致，誤差不超過表 4 中規定的范圍。質譜分析所 得的色譜質譜圖如圖 1 所示，樣品及樣品加標總離子流圖如圖 2
在 0.5、1、2 μg/kg 的加標濃度下，每個加標濃度平行測定 6 次，進行方法回收率討論。如表 5 所示，甲硝唑的回收率為 78%–96%，RDS ≤ 6.1%，表明該方法的回收率和精度*甲 硝唑的定量分析要求。 每 10 個樣品測定 1 個加標回收率，樣品數小于 10 個，至少測定 1 個加標回收率。回收率實驗采用 0.5、1、2 μg/kg 三個加標濃 度，每個加標濃度平行測定 6 次，回收率和精度見表 5。通過對 加標樣品的總離子流圖進一步分析得到，按 3 倍信噪比測得的檢 測限 (LOD) 為 0.5 µg/kg，以 10 倍信噪比測得的定量限 (LOQ) 為 1.5 µg/kg。
本文所述使用 Bond Elut PCX 固相萃取柱和 1290 Infinity II 液相色譜系統/6460 三重四極桿液質聯用系統分析雞肉樣品中甲硝唑的 方法線性范圍寬、樣品回收率高、質譜信號良好，而且具有優異 的檢測限 (LOD) 和定量限 (LOQ)，在動物性食品獸藥殘留分析領 域有很好的應用前景。