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測定三文魚和牛肉中的 19 種多環芳烴
閱讀：738 發布時間：2020-8-24摘要：本應用簡報介紹了用于分析三文魚和牛肉中的多環芳烴 (PAH) 殘留物的多殘留方法的開發與驗證。該方法使用液相萃取以及 Agilent Captiva EMR-Lipid 凈化，并通過 GC/MS/MS 進行分析。使用固/液萃取 (SoLE) 對三文魚或牛肉樣品進行萃取，再通過 Captiva EMR-Lipid 凈化。然后使用異辛烷對凈化的樣品洗脫液進行反萃取，以在安捷倫 GC/MS/MS 分析之前去除水。在兩步法 SoLE 中使用乙酸乙酯和乙腈的混合物，改善了脂質食品基質中 PAH 的萃取效率。Agilent Captiva EMR-Lipid 過濾柱能夠實現對樣品基質的高效選擇性凈化，并采用三文魚和牛肉樣品對開發的方法進行了驗證。結果表明，所有檢測的 PAH 化合物均獲得了滿足歐盟委員會規定（回收率 50%–120%）的可接受的回收率結果，RSD 低于 20%，且三文魚和牛肉樣品中濃度為 1–500 ng/g 的分析物的校準曲線 R2 高于 0.99。通過重量法測得，三文魚和牛肉樣品中基質共萃取殘留物的去除效率分別為 60% 和 92%。
前言： PAH 是一類普遍存在的有毒化合物，其特征是具有熱力學穩定的稠合芳香環結構。這些化合物天然存在于原油和煤中，也可以于食品的加工過程中形成。PAH 化合物可根據稠合芳香環的數量進行分類，例如分為輕 PAH（具有 2–3 個環）和重 PAH（具有 4–6 個環）。重 PAH 比輕 PAH 更穩定且毒性更高。由于它們具有疑似或經證實的致突變性或致癌性，這些化合物已經得到廣泛研究和監管。美國食品藥品監督管理局 (FDA) 要求對海鮮中低 ppb 級的 PAH 進行分析1 。歐盟委員會 (EC) 規定了四種重 PAH 化合物（苯并 (a)芘、苯并(a)蒽、苯并(b)熒蒽和?）的分析方法標準，要求每種 PAH 的定量限 (LOQ) 達到 0.9 µg/kg 且檢測限 (LOD) 達到 0.3 µg/kg2 。 PAH 為強親脂性化合物，容易在魚、肉、油和牛奶等脂質食品中發生生物累積。脂質食品基質中 PAH 的分析所面臨的主要挑戰，是將目標分析物與食品基質中存在的大量脂質化合物分離。這一挑戰包括從脂肪基質中高效提取 PAH，然后選擇性去除不需要的脂肪基質共萃取物。常用的樣品前處理技術包括索氏提取3 、超聲輔助固/液萃取4 、加壓溶劑萃取5 和 QuEChERS 萃取6 。這些技術可以與固相萃取7 (SPE) 或凝膠滲透色譜8 等凈化步驟配合使用。
安捷倫增強型脂質去除 (EMR-Lipid) dSPE 凈化產品自 2015 年推出以來就備受關注。EMR-Lipid dSPE 吸附劑與脂類的無支鏈烴鏈發生選擇性相互作用，在溶液中留下大量目標分析物以供后續分析。這一選擇性相互作用使其成為脂質食品基質中多類別多殘留分析的理想選擇。與傳統的 Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid (50%) 相比，Captiva EMR-Lipid 過濾柱只需更少的水進行吸附劑活化 (20%)。這一變化簡化了工作流程，并改善了疏水性化合物在凈化過程中的回收率9 。
本研究考察了使用 Captiva EMR-Lipid 過濾柱流通式凈化進行樣品前處理，并通過 GC/MS/MS 分析三文魚和牛肉中的 19 種 PAH 化合物。開發此方法的目的在于，改善先前使用 Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid dSPE 凈化測定食品中 PAH 的方法的局限性10。表 1 顯示了所檢測的農藥的分類、Log P 值、保留時間和 MS/MS 離子對。
實驗部分：化學品與試劑 PAH 和內標來自 Ultra-Scientific (North Kingstown, RI, USA) 或安捷倫。HPLC 級乙腈 (ACN)、丙酮和乙酸乙酯 (EtOAc) 購自 Honeywell (Muskegon, MI, USA)。試劑級異辛烷購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。
溶液與標準品用丙酮配制兩種濃度分別為 2000 µg/mL 和 500 µg/mL 的 PAH 儲備液。用丙酮由儲備液制得濃度為 4 µg/mL 的工作溶液。然后每天用丙酮新鮮配制濃度為 1 µg/mL 的加標溶液以用于樣品加標。用丙酮配制包含五種濃度為 20 µg/mL 的內標化合物的內標工作溶液。兩種工作溶液均置于棕色玻璃樣品瓶中，在 4 °C 的冰箱中儲存一個月。配制 20:80 EtOAc/ACN 萃取溶劑和 16:64:20 ACN/EtOAc/水洗脫溶液，室溫儲存。
儀器與材料將 Agilent 7890B 氣相色譜系統與 Agilent 7000D 三重四極桿 GC/MS 聯用開展研究。氣相色譜系統配備電子氣路控制 (EPC)、支持風冷的多模式進樣口 (MMI)、 Agilent 7693A 自動液體進樣器 (ALS) 以及基于輔助 EPC 模塊控制的吹掃 Ultimate 接頭的反吹系統。采用 Agilent MassHunter 工作站軟件進行數據采集和分析。
結果與討論： EMR-Lipid 吸附劑和產品 EMR-Lipid 吸附劑使用新型化學鍵合相，它結合了體積排阻與疏水相互作用，可提供較高的脂質去除選擇性和效率。僅含有無支鏈烴鏈的類脂分子能夠進入 EMR-Lipid 吸附劑孔中，并通過疏水相互作用得以保留。不含類脂結構的目標分析物無法進入吸附劑孔中，因此留在溶液中以供后續分析。因此，EMR-Lipid 吸附劑可以將脂質與其他目標分析物分開，提供較高的分析物回收率和脂質去除效率。樣品前處理優化樣品前處理方法優化包括三個階段： 1. SoLE 2. Captiva EMR-Lipid 凈化 3. 用于除水的后處理萃取步驟對于實現脂肪基質中疏水性 PAH 化合物的高回收率至關重要。樣品萃取的挑戰在于 PAH 分析物的高疏水性和脂質食品基質的復雜性。鑒于 SoLE 先前在萃取油基質中疏水性農藥方面的成功應用9 ，直接使用 SoLE 和 20:80 EtOAc/ACN 萃取溶劑作為初步方案。針對分析物回收率對萃取時間和多次 SoLE 進行優化，結果如圖 3A 所示。結果表明，萃取時間越長， PAH 萃取回收率越高。另外，與一步法 SoLE 相比，兩步法 SoLE 提高了萃取效率。因此，使用兩步法 SoLE 作為萃取方法，該方法采用 5 mL 萃取溶劑，并在每一步振搖 10 分鐘。
然后研究了 EMR-Lipid 過濾柱凈化的分析物回收率。由于 PAH 化合物具有非常強的親脂性（重 PAH 尤其如此），因此使用二次洗脫對于獲得良好的洗脫回收率非常重要。結果（圖 3B）表明，二次洗脫能夠使洗脫回收率平均提高約 20%– 25%。此外，使用更強的溶劑（16:64:20 EtOAc/ACN/水）可實現重 PAH 的洗脫。對樣品萃取和 EMR-Lipid 凈化進行優化后，考察了用于除水的后處理步驟。用于在 GC/MS/MS 分析之前除水的 EMR-Lipid 后處理方法主要有三種： • 使用無水 MgSO4 進行鹽析 • 干燥和復溶 • 疏水性溶劑反萃取 (BE) 表 3 分別列出了這三種后處理程序的一般方法、優缺點和適用性。由于 PAH 是一類強疏水性化合物，因此非常適合采用疏水性溶劑反萃取法。該方法可實現溶劑轉換和部分濃縮，并且對于輕 PAH 和重 PAH 化合物均適用。因此，在 Captiva EMR-Lipid 凈化后使用異辛烷溶劑 BE 除水。圖 3C 顯示了異辛烷 BE 步驟的回收率。使用這種優化的方法，在三種加標濃度下采集整個方法的分析物回收率：三文魚和牛肉樣品中加標濃度均為 1 ng/g、10 ng/g 和 100 ng/g (n = 6)。盡管不同基質間存在差異，但兩種基質中不同加標濃度的所有 PAH 分析物的回收率均處于可接受的限值范圍 (50%–120%)。