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應用Ultivo LC/TQ對血漿中的褪黑素進行常規定量研究
閱讀：676 發布時間：2020-7-6摘要：本應用簡報介紹了使用 Agilent 1260 Infinity II Prime 液相色譜與配備 ESI 離子源的 Agilent Ultivo 三重四極桿 LC/MS 聯用系統對褪黑素 (MEL) 進行的定量研究。對于加標至血漿中的褪黑素-D4 (MEL-D4)，經優化的 LC/MS 方法獲得了 10 pg/mL 的定量下限 (LLOQ)。這種高靈敏度的快速研究方法可以定量分析通過簡單的蛋白質沉淀方法前處理的復雜人血漿提取物中的低濃度內源性 MEL。
前言 ：MEL 是一種內源性激素和強效的神經遞質，幫助調節生理節律和睡眠，通常用于治療失眠等睡眠障礙。有關藥代動力學和內源性 MEL 產生的研究需要能夠測量低分布濃度的 MEL 的分析技術，該濃度隨個體和一天中時間的變化而變化。由于 LC/MS/MS 方法比傳統的放射免疫分析具有更高的特異性，該方法已經得到廣泛應用，目前已經開發了 LC/MS/MS 方法以滿足對血漿中 MEL 進行高靈敏度和高特異性定量的生物分析要求。本應用簡報表明 1260 Infinity II Prime 液相色譜與配備 ESI 離子源的 Ultivo LC/TQ 的聯用系統可獲得精確定量人血漿中的 MEL 所需的分析靈敏度。
實驗部分：試劑與化學品所有試劑和溶劑均為 HPLC 或 LC/MS 級。乙腈和甲醇購自 Honeywell (Morristown, NJ, USA)。超純水產自配備 LC - Pa k Polisher 和 0.22 µm 膜式終端過濾器濾芯的 Milli-Q Integral 系統 (EMD Millipore, Billerica, MA, USA)。LC/MS 級甲酸購自 Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ, USA)。氟化銨和 LC/MS 級甲酸銨購自 Millipore Sigma (St. Louis, MO, USA)。MEL (≥ 98%) 和 MEL-D4（≥ 98% MEL，≥ 99% 氘代形式 D1–D4）購自 Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)。NIST SRM 1950 人血漿購自 Millipore Sigma。檸檬酸鹽人血漿也購自 Millipore Sigma，僅用于回收率研究。對于血漿中 MEL-D4 的 LLOQ 測定，采用血漿提取物配制 13 個校準濃度，濃度范圍為 10 pg/mL 至 100 ng/mL。根據制造商對氘代 MEL (D1–D4) 的建議，首先通過與標準曲線相關的定量離子對（237.1 & 178.1 與 233.1 & 174.1）峰強度比，根據精確量的未標記 MEL 對此標準儲備混合液進行定量。我們并未在 MEL-D4 中觀察到大量的 D0 形式。在純溶劑中分析 100 ng/mL MEL-D4 時沒有明顯的未標記 MEL MRM 信號 (< 0.1%) 可以證明這一點。
樣品前處理：對于所有實驗，血漿的蛋白質沉淀步驟如下：將 EDTA (0.5 mol/L, 50 µL) 加入到 200 µL 于冰上保存的血漿等分試樣中，短暫渦旋混合。加入乙腈 (750 µL)，渦旋 30 秒，在冰上孵育 20 分鐘，然后在 4 °C 下以 16000 × g 的速度離心 10 分鐘以沉淀蛋白質。將有機上清液 (800 µL) 轉移至 2 mL 棕色 LC/MS 樣品瓶中，利用真空濃縮儀對其進行干燥。將提取物復溶于 100 µL 甲醇，超聲水浴處理 5 分鐘，然后轉移至 250 µL 玻璃自動進樣器樣品瓶內插管中，用于 LC/MS 分析。此外，需使用重組血漿配制校準曲線樣品。 MEL 是一種光敏化合物，注意盡量減少光照。對于回收率評估，在提取之前（預加標），向四個血漿重復試樣中加標 MT-D4，加標濃度為 1 ng/mL。將上述重復試樣與后加標的四個血漿重復試樣進行比較，計算回收率。為了測定內源性 MEL，向一份血漿等分試樣中預加標 MT-D4，加標濃度為 10 ng/mL，以校正樣品前處理中的損失，實現準確定量。
儀器： Agilent 1260 Infinity II Prime 液相色譜儀： • Agilent 1260 Infinity II Prime 全能泵 (G7104C) • Agilent 1260 Infinity II Multisampler，配備冷卻裝置 (G7167A) • Agilent 1260 Infinity II 高容量柱溫箱 (G7116A) • Agilent Ultivo 三重四極桿液質聯用系統 • 安捷倫電噴霧離子源 (G1948B)
結論：本應用簡報證明 Ultivo-ESI 具有與標準 Ultivo 系統相媲美的出色性能。它實現了定量研究血漿中低 ppt 級褪黑素所需的分析靈敏度。此系統也是一款經濟適用的儀器，能夠定量血漿中低濃度的內源性褪黑素，并且僅需極少的樣品前處理。