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硝基呋喃類(lèi)抗生素藥物及其代謝物具有制畸胎副作用，且能誘發(fā)癌癥，引起了人們的高度關(guān)注。歐盟、美國(guó)、中國(guó)等諸多國(guó)家和地區(qū)先后禁止在動(dòng)物源性食品中使用，檢測(cè)限為不得檢出。硝基呋喃原藥 對(duì)光敏感，在動(dòng)物體內(nèi)迅速被代謝，故檢測(cè)在食品中的代謝物。

 

化學(xué)試劑 硝基呋喃（nitrofuran）化合物名稱(chēng)、分子式和CA號(hào)： 呋喃它酮  3-Amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinon，其代謝物為AMOZ，C8H15N3O3，CAS: 43056-63-9 呋喃唑酮  3-Amino-2-oxazolidinone ，其代謝物為AOZ，C3H6N2O2，CAS: 80-65-9 呋喃西林  Semicarbazide，其代謝物為 SEM，CH5N3O，CAS: 57-56-7 呋喃妥因  1-Amino-hydantoin ，其代謝物為AHD，C3H5N3O2，CAS: 2827-56-7 硝基呋喃化合物及代謝物的結(jié)構(gòu)：

 

A：將藥物代謝物從組織中提取出來(lái)；B：藥物代謝物與2-硝基苯j(luò)ia醛(2-NBA，C7H5NO3，CAS: 552-89-6) 的衍生化反應(yīng)。 建議的內(nèi)標(biāo)：D4-AOZ，D5-AMOZ，13C15N2-SEM，13C3-AHD。

 

色譜分離流動(dòng)相的制備 1 M乙酸銨溶液：77 g乙酸銨溶解于1 L HPLC級(jí)的水中。 流動(dòng)相A：在1 L HPLC級(jí)的水中，加入1 mL 1 M 乙酸銨溶液。 流動(dòng)相B：在1 L HPLC級(jí)的甲醇中，加入1 mL 1 M 乙酸銨溶液。

 

樣品制備(肉、蝦樣品) 基于 Leitner 等人提出的方法[1]： 1． 稱(chēng)取1 g勻漿的組織樣品； 2．加入內(nèi)標(biāo)； 3．加入0.125 M鹽酸和2-硝基苯j(luò)ia醛(2-NBA)； 4．調(diào)節(jié)pH值為7.4； 5．離心； 6．用乙酸乙酯在 Extrelut 柱上提取上清液； 7．揮干溶劑； 8．用500 µL流動(dòng)相[水+1 mM乙酸銨 / 甲醇＝90 / 10]。 回收率[2]：AOZ ～70%；AMOZ ～80%；SEM ～70%；AHD ～70%。

 

樣品制備(肝臟組織) 基于Conneely等人提出的方法[3]： 1．稱(chēng)量5 g浸水并勻漿過(guò)的肝臟組織，衍生化過(guò)夜； 2．將樣品溶液pH值調(diào)成中性，用乙酸乙酯提取，揮干溶劑； 3．將殘?jiān)苡? mL水中，上樣到準(zhǔn)備好的MAX柱上； 4．先用2%氨水溶液3 mL清洗，然后用3 mL甲醇進(jìn)行洗脫，揮干溶劑； 5．將殘?jiān)苡? mL水中，上樣到準(zhǔn)備好的HLB柱上； 6．先用2%乙酸溶液(溶劑：水 + 甲醇＝1/1) 3 mL清洗； 7．然后用3 mL溶于90%甲醇中的2%的氨水溶液進(jìn)行洗脫。

 

樣品制備(蜂蜜樣品) 基于Blake等人提出的方法[1]： 1．加50 µL內(nèi)標(biāo)溶液到5 g蜂蜜中； 2．熱水中超聲5 min，使混合均勻； 3．加入20 mL 0.3 M鹽酸(混合300 mL 1 M HCl和700 mL的水制成)，振搖使均勻； 4．加入1 mL衍生化試劑(將1 g 2-NBA溶解于50 mL二甲亞砜DMSO中制成，用前新鮮配制)； 5．渦流混旋1 min，使混合均勻，37 ℃保溫16 h進(jìn)行衍生化； 6．加入2 mL 1 M磷酸緩沖液(磷酸緩沖液pH=7.4)，加入1 M NaOH(7.3～8.2 mL)到溶液pH=7±0.5，注 意：pH值不可以超過(guò)7.5； 7．加入15 mL HPLC級(jí)的乙酸乙酯，渦旋混合5 min； 8．在3000 r/min離心10 min，直至有機(jī)相與水相明顯分層，如果沒(méi)有很好分層，繼續(xù)離心；分析硝基呋喃代謝物的實(shí)驗(yàn)方法9．仔細(xì)轉(zhuǎn)移上面乙酸乙酯層溶液5 mL，到一干凈的16 mm×100 mm的玻璃試管中意不要將下面 水層溶液帶入； 10．蒸發(fā)到只剩1 mL左右； 11．再仔細(xì)轉(zhuǎn)移出3 mL上層乙酸乙酯溶液，到相同玻璃試管中； 12．蒸發(fā)到只剩1/2時(shí)，渦旋混合，再蒸發(fā)至干； 13．加入200 µL甲醇進(jìn)行溶解，再加入200 µL水，混合均勻。然后取出200 µL到樣品瓶中，備用。

 

色譜分離條件 Agilent 1100 系統(tǒng)：G1312A二元泵系統(tǒng)、G1367A型自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱。 色譜柱：Phenomenex LUNA，3 µm，C18(2)，150 mm×2 mm。 流動(dòng)相：A相—水 + 1 mM 乙酸銨；B相—甲醇 + 1 mM 乙酸銨。 梯度設(shè)置： 

 

MS/MS檢測(cè) AB API 3000™ LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀系統(tǒng)，TurboIonSpray® 離子源，正離子模式，MRM掃描方式