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液相色譜系統(tǒng)分析初榨橄欖油中的生育酚和生育三烯酚
閱讀：1377 發(fā)布時(shí)間：2019-8-13本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)中展示了利用帶熒光檢測(cè)的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)對(duì)初榨橄欖油中的生育酚和生育三烯酚進(jìn)行正相色譜分析。結(jié)果顯示，與標(biāo)準(zhǔn)的不 銹鋼系統(tǒng)相比，使用生物惰性系統(tǒng)可大大改善保留時(shí)間及峰面積的精度。所有八種維 生素 E 異構(gòu)體均具有*的線性，且檢測(cè)限 (LOD) 和定量限 (LOQ) 均在低 µg/mL 范圍 內(nèi)。九個(gè)橄欖油樣品的分析結(jié)果表明：橄欖油中 a-生育酚的含量為 100 至 390 mg/kg。 且檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不*精制和初榨橄欖油中的維生素 E 含量相同。
初榨橄欖油來(lái)自橄欖樹(shù) (Olea europea L.) 的果實(shí)，加工過(guò)程僅使用機(jī)械壓榨，不采 用任何熱或化學(xué)處理。為確保初榨橄欖油 產(chǎn)品的真實(shí)性，包括無(wú)摻假、錯(cuò)貼標(biāo)簽、 描述錯(cuò)誤或產(chǎn)地誤導(dǎo)，過(guò)去二十年里已建 立有大量用于評(píng)估植物油的方法1。其中 對(duì)于熱處理橄欖油的分析，在之前的應(yīng)用 簡(jiǎn)報(bào)中已有詳細(xì)介紹2,3,4 。
營(yíng)養(yǎng)學(xué)優(yōu)勢(shì)方面，初榨橄欖油是許多生物 活性成分的來(lái)源，這些成分對(duì)人體健 康有較高的化學(xué)保護(hù)作用。除了高含量的 單不飽和及多不飽和脂肪酸之外，它還含 有價(jià)值*的抗氧化成分，如植物甾醇、 類胡蘿卜素、酚類和維生素 E5,6 。這些生 物活性成分的含量與基因、栽培和環(huán)境因 素相關(guān)。“維生素 E”這個(gè)名稱包含四種生 育酚（a-、b-、g- 和 d-生育酚）和四種 生育三烯酚（a-、b-、g- 和 d-三烯生育 酚）異構(gòu)體。所有這八種形式均包含一個(gè) 色原烷醇環(huán)和一個(gè)異戊二烯基，生育三烯 酚中具有 3 個(gè)雙鍵，見(jiàn)圖 1。在初榨橄欖 油中，生育酚/生育三烯酚總含量的 95% 是 a-生育酚6 。
由于維生素 E 的生物活性具有多樣性，且 與大多數(shù)單體生育酚和生育三烯酚在癌癥 或梗塞預(yù)防中的作用相關(guān)，因此有必要對(duì) 維生素 E 進(jìn)行全面的譜圖分析6。采用合 適的色譜技術(shù)對(duì)所有維生素 E 異構(gòu)體進(jìn)行 分離、鑒定和定量是對(duì)維生素 E 進(jìn)行全面 譜圖分析的重要因素。反相 (RP) 和正相 (NP) 高壓液相色譜 (HPLC) 均可用于分析 生育酚和生育三烯酚。本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)中采用 了正相超高壓液相色譜 (UHPLC)，此系統(tǒng) 可實(shí)現(xiàn)所有維生素 E 異構(gòu)體的良好分離6 。 維生素 E 異構(gòu)體的熒光性質(zhì)使其可通過(guò)靈 敏的熒光檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
已知生育酚非常敏感，常會(huì)發(fā)生降解，產(chǎn) 物包括（例如）生育酚紅、生育酚紫、 對(duì)生育酚、醌和二聚反應(yīng)產(chǎn)物7。特別是 在光致氧化作用下會(huì)發(fā)生降解過(guò)程，同 時(shí)在 Fe3+ 或 Cu2+ 離子存在時(shí)的氧化作用 下也會(huì)發(fā)生降解7。由于后者的原因，在 不銹鋼 HPLC/UHPLC 體系中進(jìn)行的液相 色譜分析常會(huì)得出非常差的保留時(shí)間和峰 面積精度。為比較保留時(shí)間 (RT) 和峰面 積的重現(xiàn)性，本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)中同時(shí)采用不 銹鋼（Agilent 1260 Infinity 四元液相色 譜系統(tǒng)）和生物惰性系統(tǒng)（Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)）進(jìn)行 分析。
實(shí)驗(yàn)部分 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色 譜系統(tǒng)，包括以下模塊： • Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元泵 (G5611A) • Agilent 1260 Infinity 生物惰性自 動(dòng)進(jìn)樣器 (G5667A) • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1330B)， 用于樣品冷卻 • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C)， 配置生物惰性溶劑熱交換器 • Agilent 1260 Infinity 熒光檢測(cè)器 (G1321B)，配置生物惰性標(biāo)準(zhǔn) FLD 流通池 Agilent 1260 Infinity 四元液相色譜系統(tǒng)， 包括以下模塊： • Agilent 1260 Infinity 四元泵 (G1311B) • Agilent 1260 Infinity 自動(dòng)進(jìn)樣器 (G1367E) • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1330B)， 用于樣品冷卻 • Agilent 1290 柱溫箱 (G1316C) • Agilent 1260 Infinity 熒光檢測(cè)器 (G1321B)，配置標(biāo)準(zhǔn) FLD 流通池要在 1260 Infinity 四元液相色譜系統(tǒng)（不 銹鋼和生物惰性）中執(zhí)行正相色譜分析， 清洗和柱塞桿密封墊必須從反相（標(biāo)配） 更換為正相部件： • 柱塞桿密封墊 - 正相（部件號(hào) 0905- 1420） • 清洗密封墊 (PE)（部件號(hào) 0905-1718）
樣品 生育酚和生育三烯酚混合溶液標(biāo)準(zhǔn)品（溶 于庚烷）購(gòu)自 LGC 標(biāo)準(zhǔn)品公司（特丁頓， 英國(guó)）。一系列橄欖油（初榨及不*精制 橄欖油）購(gòu)自本地商店。對(duì)于正相分析， 橄欖油樣品采用庚烷稀釋至 100 mg/mL 的 濃度，然后注射入 UHPLC 系統(tǒng)進(jìn)行分析。溶劑 正庚烷及甲基叔丁基醚 (tBME)均為 LC級(jí)， 購(gòu)自西格瑪奧德里奇公司（圣路易斯，密 蘇里州，美國(guó)）。 色譜柱 Agilent LiChrospher DIOL 色譜柱， 4 × 250 mm，5 µm（部件號(hào) 79925DI-584） 軟件 Agilent OpenLAB CDS ChemStation 版， 適用于 LC 和 LC/MS 系統(tǒng)，修訂版 C.01. 04 [35]
結(jié)果與討論 圖 2 中展示了采用正相色譜法成功分離生 育酚和生育三烯酚標(biāo)準(zhǔn)品（來(lái)自 LGC 標(biāo) 準(zhǔn)品公司）中的所有維生素 E 異構(gòu)體的色 譜圖。實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定了兩種系統(tǒng)（1260 Infinity 四元液相色譜系統(tǒng)及 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)）中保留時(shí)間 和峰面積的精度。圖 2 所示為生物惰性系 統(tǒng)中六次分析的疊加圖，其中的保留時(shí)間 和峰面積均具有出色的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。 表 2 總結(jié)了兩種系統(tǒng)中維生素 E 異構(gòu)體分 析的結(jié)果。在生物惰性系統(tǒng)中，保留時(shí)間 精度和峰面積結(jié)果更為優(yōu)異，這是由于存 在 Fe3+ 離子時(shí)異構(gòu)體會(huì)經(jīng)歷氧化過(guò)程7 。 對(duì)于保留時(shí)間精度，生物惰性系統(tǒng)可表 現(xiàn)出高達(dá)十倍的性能提高，例如 a-生育 酚在該系統(tǒng)下的保留時(shí)間精度值 RSD 低 于 0.07%，而在不銹鋼系統(tǒng)中的 RSD 為 0.68%。同時(shí)，使用生物惰性系統(tǒng)時(shí)，峰 面積的精度也可提高三至十倍（a-生育酚 為四倍）。
為測(cè)定線性、LOD 及 LOQ，使用正庚烷以 1所有的維生素 E 異構(gòu)體均具有*的線 性，相關(guān)系數(shù)均大于 0.9998。LOD 及 LOQ 均在低 µg/mL 范圍內(nèi)，例如在橄欖油中， 少量的 b-生育酚及 b-生育三烯酚也可被 檢測(cè)出。比例逐級(jí)稀釋生育酚和生育三烯酚 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，見(jiàn)表 3。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備了八個(gè)不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶 液，然后計(jì)算峰面積和對(duì)應(yīng)濃度之間的線 性關(guān)系。LOD 及 LOQ 分別定義為信噪比 3:1 及 10:1 時(shí)的濃度。表 4 列出了所有維 生素 E 異構(gòu)體的線性、LOD 及 LOQ 結(jié)果。
圖 3 中展示了初榨橄欖油中維生素 E 異構(gòu) 體的組成分析。與文獻(xiàn)報(bào)道類似6，初榨 橄欖油中總維生素 E 異構(gòu)體含量的 95% 為 a-生育酚。此外，還可檢測(cè)到少量的 g-生 育酚，b-生育酚及 b-生育三烯酚。 實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)了九種橄欖油樣品中的維生素 E 含量，見(jiàn)表 5。所測(cè)定維生素 E 異構(gòu)體： a-、b-、g 生育酚及 b-生育三烯酚的含 量與文獻(xiàn)中描述的含量一致，例如，a-生 育酚的含量約為每千克橄欖油中含 100 至 390 mg6,8 。不*精制（樣品 3）和初榨 橄欖油（樣品 1，2 和 4 - 8）在維生素 E 含量方面沒(méi)有任何差異。
結(jié)論 存在 Fe3+ 或 Cu2+ 離子時(shí)，生育酚會(huì)因氧 化作用而發(fā)生降解7。因此，在分析生育 酚和生育三烯酚時(shí)，若想獲得高精度的 保留時(shí)間和峰面積，我們強(qiáng)烈建議使用 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)。此生物惰性系統(tǒng)可將保留時(shí)間的 精度提高多達(dá)十倍，此外，生物惰性系統(tǒng) 還可改善約十倍的峰面積精度。 將采用庚烷的正相色譜法與生物惰性系統(tǒng) 聯(lián)用，八種維生素 E 異構(gòu)體均可獲得* 的線性，并且 LOD 及 LOQ 值均在低 µg/mL 范圍內(nèi)。所測(cè)九種橄欖油樣品中的生育 酚/生育三烯酚含量為 100 至 390 mg/kg 橄欖油（以 a-生育酚為例）。不*精制 和初榨橄欖油中維生素 E 的含量無(wú)差異。