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安捷倫LC/MS/MS對嬰兒配方奶進行黃qu霉毒素分析
閱讀：899 發布時間：2019-8-8黃qu霉毒素 M1 是牛奶中主要的一種黃qu霉毒素。歐盟委員會 (EC) 規定歐洲嬰兒配 方奶中該物質的大濃度為 0.025 µg/kg。在美國，食品和藥品監督管理局 (FDA) 規定 牛奶中黃qu霉毒素的干預濃度為 0.5 µg/kg。本應用簡報介紹了采用 Agilent Bond Elut 增強型脂質去除產品 EMR-Lipid 通過 LC/MS/MS 對嬰兒配方奶中的黃qu霉毒素 M1、G2、 G1、B2 和 B1 進行測定。本研究首先采用 QuEChERS 萃取，然后采用 EMR-Lipid 分散 式固相萃取 (dSPE) 進行凈化。該方法可使所有濃度的所有黃qu霉毒素實現出色的回收 率 (88%-113%) 與精密度 (RSD = 1.3%-13.6%)。由于充分的基質去除，其定量限 (LOQ) 要遠遠低于美國和歐洲的法規限值。這一簡單而穩定的方法僅需極少設備和專業技術， 因此可在食品實驗室中實現輕松應用
真菌毒素是真菌的次生代謝產物，是食品和飼料供應中常 見的污染物之一。糧食及農業組織 (FAO) 估計世界上有多 達 25% 的農產品受到了真菌毒素的污染。這種污染會造成災難 性的經濟損失，對糧食產業而言更是如此 [1]。黃qu霉毒素（表 1） 是由多種真菌（特別是黃qu霉和寄生曲霉）產生的一類真菌毒 素 [2]。黃qu霉毒素 M1 是牛奶中常見的真菌毒素，奶牛食用 了受黃qu霉毒素 B1 污染的飼料并對其進行代謝后即可產生黃qu霉毒素 M1 [3]。美國食品和藥品監督管理局 (FDA) 以及歐盟委 員會 (EC) 均已對多種食品中的黃qu霉毒素限值進行了規定 [4,5]。 表 2 總結了美國和歐洲的 FDA 和 EC 黃qu霉毒素限值。
黃qu霉毒素的法規限值極低，在嬰兒食用的乳制品基質和配方奶 中更是如此。為去除基質干擾以增強低濃度下的分析物信號，樣 品前處理*。通常使用免疫親和柱分析多種包括黃qu霉毒 素在內的真菌毒素 [6-9]。但這類色譜柱價格昂貴，并需要采用 對食品實驗室來說并不方便的*的多種工作流程。快速、簡便、 經濟、、耐用和安全的 QuEChERS 方法針對樣品采用簡單的 三步流程（萃取、凈化和分析）。因此，該方法在谷物和乳制品 中包括黃qu霉毒素在內的多種不同分析物和基質的前處理方面極 具前景 [3,10,11]。但通過 C18 或 PSA 進行的 QuEChERS 凈化 在分析肉類和牛奶等含有大量脂質的樣品時有一定限制。這種限 制來自于與目標分析物的非選擇性相互作用以及幾乎無法去除的 主要脂類物質。所有殘留的脂質均會聚集于分析流路中，從而導 致維護次數增加、色譜圖異常，并大大降低數據準確度和精密度。
Agilent Bond Elut 增強型脂質去除產品 EMR-Lipid 是一種新型 吸附劑，該產品結合了*的體積排阻和疏水相互作用，可選擇 性去除樣品中的主要脂類，且不會保留不需要的其他分析物。這 種吸附劑可用于通過 QuEChERS 進行的 dSPE 凈化以及蛋白質 沉淀工作流程，有助于實現簡單的凈化 [12,13]。本研究對 嬰兒配方奶中的五種黃qu霉毒素進行了分析。嬰兒配方奶富含脂 質且有明確的黃qu霉毒素法規限值，因此選擇它作為基質。在 QuEChERS 萃取后進行 EMR-Lipid dSPE 凈化，并使用無水 MgSO4 進行增強的樣品（凈化）后處理（步驟），可獲得出色的 基質去除效果。本應用簡報證實了 EMR-Lipid 在三種不同濃度的 黃qu霉毒素分析中的有效性。
實驗部分 試劑與化學品 所有試劑均為 HPLC 級或更高等級。乙腈 (ACN) 和甲醇購自 Honeywell (Muskegon, MI, USA)。水的凈化處理由 EMD Millipore Milli-Q Integral 系統 (Darmstadt, Germany) 完成。試劑級甲酸 （FA，部件號 G2453-85060）來自安捷倫科技公司。歐洲標準 物質 ERM-BD283（含低濃度黃qu霉毒素 M1 的全脂奶粉）購自 LGC Standards (Teddington, Middlesex, UK)。黃qu霉毒素 M1 （10 µg/mL，溶于乙腈）、黃qu霉毒素混合物（B1、G1、B2、 G2：均為 20 µg/mL，溶于乙腈）以及甲酸銨購自 Sigma-Aldrich 公司 (St. Louis, MO, USA)。根據生廠商的建議，黃qu霉毒素標 準儲備溶液分別在 2-8 °C (M1) 以及 -20 °C（B1、B2、G1、G2 混合物）下儲存。液態即食嬰兒配方奶購自當地雜貨店。
設備 所用的儀器與材料： • Eppendorf 移液器和連續分液器 • 渦旋儀和多管渦旋儀 (VWR, Radnor, PA, USA) • Geno/Grinder (SPEX, Metuchen, NJ, USA) • Centra CL3R 離心機 (Thermo IEC, MA, USA) • Turbovap LV (Biotage, Charlotte, NC, USA) • Eppendorf 微量離心機 (Brinkmann Instruments, Westbury, NY, USA) • Agilent Bond Elut 早期 QuEChERS 方法（無緩沖鹽）萃取試 劑盒（10 g 樣品），配有陶瓷均質子（部件號 5982-5550CH） • Agilent Bond Elut EMR-Lipid dSPE 增強型脂質去除凈化管 （部件號 5982-1010） • Agilent Bond Elut EMR-Lipid Polish MgSO4 反萃管（部件號 5982-0102）
儀器 采用 Agilent 1290 Infinity LC 進行分析，其中包括： • Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A) • 配備 Agilent 1290 FC/ALS 溫控裝置 (G1330B) 的 Agilent 1290 Infinity 高性能自動進樣器 (G4226A) • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C) 該液相色譜系統聯用配備安捷倫噴射流電噴霧離子化技術的 Agilent 6460A 三重四極桿 LC/MS/MS 液質聯用系統。采用 Agilent MassHunter 工作站軟件進行所有的數據采集和分析。
樣品前處理 取液態嬰兒配方奶 (10 mL) 加入 50 mL 離心管中，并添加適量 標準品作為質量控制 (QC) 樣品。加入兩粒陶瓷均質子及 10 mL 乙腈，然后將樣品渦旋混合 2 分鐘。在樣品中加入早期（非緩沖 鹽，10 g 樣品）QuEChERS 萃取鹽包。在機械振蕩器中將樣品混合 2 分鐘，然后在 5000 rpm 下離心 5 分鐘。在 EMR-Lipid dSPE 增強型脂質去除凈化管中加入 5 mL 水，然后加入 5 mL 樣品粗 提物。立即對樣品進行渦旋混合，然后用多管渦旋儀繼續渦旋混 合 60 秒。將樣品在 5000 rpm 下離心 5 分鐘，然后將其倒入另一 個空的 15 mL 離心管中。將 Polish 除脂萃取鹽包中的無水硫酸 鎂 (MgSO4) 加入萃取液中。立即將樣品渦旋混合 60 秒以分散其 中的鹽，然后以 5000 rpm 離心 3 分鐘。將上清液移至含有 1.5 g MgSO4（來自新的 Polish 除脂萃取鹽包）的 15 mL 離心管中。立 即對樣品進行渦旋混合，然后再次渦旋混合 60 秒。以 5000 rpm 離心 3 分鐘后，將終樣品 (1 mL) 轉移至一個 16 × 100 mm 的 玻璃試管中，并在 50 °C 下用氮氣吹干。吹干前需要向空白基質 中加入校準標樣。用 100 µL 含有 0.1% 甲酸/乙腈 (80/20) 的水 對樣品進行復溶，并渦旋混合至少 2 分鐘。然后對樣品進行超聲 處理與離心（如需要）。將終樣品轉移至帶內襯管的樣品瓶中 進行 LC/MS/MS 分析。圖 1 展示了整個樣品前處理過程。
校準標樣和質量控制 將儲備液用乙腈稀釋制得黃qu霉毒素工作溶液，濃度分別為 2 µg/mL（黃qu霉毒素 M1）和 10 µg/mL（黃qu霉毒素 G2、G1、 B2 和 B1）。為滿足不同的法規限值要求，黃qu霉毒素 M1 的濃 度比其他黃qu霉毒素的濃度低 5 倍。通過對工作溶液進行適當稀 釋而制得 100x 終濃度的校準品和 QC 標準品。表 4 列出了嬰 兒配方奶中校準品和 QC 樣品的終濃度。將工作溶液、所有校 準品及所有 QC 標準品均置于棕色瓶于 2-8 °C 下儲存。在萃取前， 向基質空白嬰兒配方奶中加入 100 µL 的相應 QC 標準品。而對 于基質匹配校準標樣，在吹干前向 990 µL 的基質空白乙腈萃取液 中加入 10 µL 適當校準標樣。
結果與討論 方法優化 EMR-Lipid 可用于蛋白質沉淀和 QuEChERS 工作流程中。初步 測試表明，蛋白質沉淀和 QuEChERS 流程均適用于液態嬰兒配方 奶中的黃qu霉毒素分析。而由于傳統蛋白質沉淀過程中的稀釋因 子較大，故在本應用中選擇 QuEChERS 方法。在進行了預實驗后， 對本應用選擇了早期 QuEChERS 萃取鹽，但 AOAC 與 EN 萃取 鹽均適用。根據信噪比 (S/N) 標準得知，為達到黃qu霉毒素 M1 的預期定量 限 (LOQ)，需要對樣品采用濃縮步驟。分別對 5x、10x 和 20x 濃 度進行評估后發現，在給定的儀器設置下，10x 濃度可滿足 LOQ 和方法的需求。圖 2 展示了在經過 QuEChERS 萃取、EMR-Lipid 凈化以及采用 MgSO4 的增強的樣品（凈化）后處理（步驟），嬰 兒配方奶中黃qu霉毒素的 LC/MS/MS dMRM 色譜圖。