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在線固相萃取非抑制離子色譜法測定嬰兒配方奶粉中的左旋肉堿
閱讀：778 發布時間：2019-5-30左旋肉堿（L-Carnitine, β-羥基γ-*銨丁酸）又稱肉毒堿或維生素 BT，其化學式為C7H15O3N，分子量為162.2，是一種類氨基酸。L-肉堿作為 載體將長鏈脂肪酸從腺粒體膜外輸送到膜內，促進脂肪酸的β-氧化，從降低 血清膽固醇及甘油三脂的含量，提高機體耐受力及減少代謝毒性作用[i-iv]。對 嬰幼兒來說，L-肉堿在維持嬰幼兒生命及許多促進發育的生理過程，如生酮 作用、蛋白質代謝等方面均有一定的功能[v,vi]。我國及許多其它國家已規定在 嬰幼兒食品配方中添加適量的L-肉堿，以滿足其生理需要，更好地促進嬰幼 兒健康成長[vii-x]。
左旋肉堿極性較強，缺少發色基團，定量分析困難。國內外對左旋肉堿 的測定主要有酶法[xi,xii]、電泳[xiii,xiv]、流動相注射串聯質譜法[xv]，液相色譜 法[xvi-xix]等。酶法專屬性強，但前處理繁瑣，液相色譜法中低波長檢測則 干擾較多，衍生法靈敏度高，但前處理復雜，所用衍生劑毒性強。其它方法 有的靈敏度較低。有的設備較貴等原因較少使用。
離子色譜法可測定在水溶液中能電離的物質。在酸性溶液中，左旋肉堿 表現為陽離子特性，帶正電荷，可用陽離子交換色譜柱分離。但左旋肉堿的 兩性特征使其在抑制后呈電中性，無法采用抑制型電導檢測。同時，奶粉中 左旋肉堿添加量較低，需要更低檢出限的測定方法。為此，我們通過實驗， 摸索出左旋肉堿的在線固相萃取非抑制型離子色譜測定的新方法。該方法前 處理簡便、檢測快速，用于奶粉樣品中左旋肉堿的檢測，結果令人滿意
測試條件
儀器：賽默飛戴安ICS系列離子色譜系統帶雙六通閥及雙泵。 分析柱: IonPac CS17 + IonPac CG17，4 mm 濃縮柱: IonPac TCC-UPL1 MSA：0-20 min，3 mM；流速：1 mL/min 柱溫：30 ℃
檢測方式：抑制型電導檢測
進樣量：500 µL
樣品前處理
稱取奶粉樣品約1 g至50 mL比色皿中，加入超純水 14 mL，適當搖晃，使奶粉充分溶解后加入21 mL乙腈沉淀蛋白，靜置10 min，取上層清液，10000 r/min離心 10 min后，稀釋5倍，將稀釋液依次通過0.22 µm尼龍濾膜 和OnGuard II RP柱、Na柱，棄去6 mL初始流出液后采集 2 mL樣品用于離子色譜測定。 OnGuard II RP柱（規格2.5 cc），預先使用10 mL甲 醇和15 mL水活化。 OnGuard II Na柱，用10 mL水活化。
結果與討論
1. 前處理條件的選擇
奶粉配方比較復雜，含有大量蛋白質、糖和鹽。如 果奶粉中的蛋白質不經去除而直接進入色譜柱，則可能 吸附在色譜柱上，導致色譜柱柱效降低甚至失效。沉淀 蛋白質的常用方法有重金屬鹽沉淀法、酸沉淀法、有機 溶劑沉淀法等。人為引入金屬鹽會導致去除成本升高， 去除不干凈可能導污染色譜柱而使色譜柱失效。如果采 用酸沉淀法，會引入大量氫離子，對左旋肉堿出峰產生 干擾。因此，這兩種方法在本試驗中均不考慮。采用加 入乙腈沉淀蛋白的方法，沉淀蛋白效果較好，可得到 澄清的上層溶液。通過在1 g奶粉中加入1 mL、2 mL、 5 mL、10 mL、14 mL的高純水來溶解奶粉，發現如果加 入水的量過少，則奶粉溶解不充分，考慮到檢出限的限 制，我們用14 mL高純水來溶解1 g奶粉樣品。用乙腈來沉 淀蛋白，乙腈的量是需要考慮的重要因素。在14 mL的奶 粉樣品中加10 mL、14 mL、18 mL、21 mL、24 mL的乙 腈，發現如果乙腈的加入量小于水的量，則蛋白沉淀不 *，大量蛋白懸浮于溶液中，無法沉淀。隨乙腈加入 量加大，沉淀蛋白速度加快，上層液更加澄清。考慮成 本因素，終確定加入乙腈量為21 mL。即可使蛋白沉淀 *，又不至于溶液中有太高比例的乙腈，導致浪費和 后續處理困難。 稀釋5倍的提取液依次通過RP柱和Na柱進行凈 化。用RP柱可除去疏水性的脂肪等物質，Na柱作為陽離 子交換柱，可除去鉀、鈣等陽離子，避免可能的干擾。
2. 閥切換條件的確定
進樣后，將閥切換到濃縮柱一邊，用純水將樣品沖入 濃縮柱，這時，殘留的陽離子及左旋肉堿濃縮在柱上，乙 腈被沖出。5分鐘后，乙腈被沖洗干凈。再將閥切換到分離 柱側，左旋肉堿在色譜柱上得到分離。比較了不同時間純 水的沖洗效果，5分鐘比較合適，可將乙腈及其它無保留雜 質沖洗干凈。閥切換配置圖如圖1所示，切換程序見表1。
3. 色譜柱的選擇 因為是非抑制電導檢測，所以為了降低噪音，需要 選擇低淋洗強度淋洗液就能洗脫的離子交換柱。在戴安 產品中符合要求的柱子有IonPac CS17、 IonPac CS18 （6.0 µm, 250 mm×2 mm）、IonPac SCS1三種不同色 譜柱。實驗發現，IonPac SCS1柱親水性差，左旋肉堿的 峰形不好。IonPac CS17、 IonPac CS18都是很低疏水性 的柱，左旋肉堿的峰形對稱性好。但實際樣品測試的時 候，IonPac CS18柱上左旋肉堿被不明峰干擾。因此，選 擇CS17 + CG17作為分析L-左旋肉堿的色譜柱。
4. 淋洗液濃度的確定
依次選用6、5、4、3、2 mmol/L的甲基磺酸，測定 奶粉中左旋肉堿的色譜分析特征，確定合適的淋洗液濃 度。結果表明：隨淋洗濃度從6 mmol/L降低到2 mmol/ L，背景電導從2231 uS降低至777 uS，噪聲降低，理 論塔板數提高，各成分間的分離度增大，峰形改善，信 噪比從12增大至67.8，但保留時間也從6.91 min增大至 15.51 min。。綜合考慮，我們選擇3 mmol/L的甲基磺酸 作為分析用淋洗液。在優化的淋洗液濃度下，標準樣品 及真實樣品的左旋肉堿色譜圖如圖2所示。
5. 干擾因素
通過在前處理時加入鈉柱，去除鎂、鈣、鉀、鐵、 銅、錳、鋅等陽離子，避免干擾左旋肉堿。干擾電導響 應的乙腈，也已經在切換濃縮過程被純水沖出濃縮柱， 因此不會干擾左旋肉堿的檢測。
6. 檢出限與線性范圍
按實驗方法在選定的色譜條件下，對左旋肉堿進行 線性和檢出限測定。取標準工作液，以高純水稀釋成 0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1 mg/L，用離子色譜進行 檢測，以峰面積y對質量濃度x（mg/L）進行作圖，得回 歸方程y=0.686x-0.006。線性范圍17.5 mg/Kg～175 mg/ Kg，相關系數r>0.9995。取標準工作液，以高純水稀釋 成0.01、0.02、0.03、0.04 mg/L，按優化條件進行處理 后，以信噪比（S/N）≥3的低濃度作為奶粉中左旋肉 堿的檢出限，測得左旋肉堿檢出限為5 mg/Kg。
7. 精密度與回收率
按實驗方法，取市售奶粉樣品進行不同濃度加標試 驗，連續進樣5次，測定左旋肉堿平均回收率和精密度， 結果列于表2，該方法的回收率在92.3%～105.2%之間， RSD在1.4%～4.3%之間。
實際樣品分析:
按實驗方法，惠氏膳兒加產品包裝上左旋肉堿標示 含量為7.7 mg/100 g、本文所測結果與之接近?；菔蠍蹆?樂和伊利奶粉包裝上未標識添加有左旋肉堿，但本試驗 依然檢出，這可能與天然奶源中就含有一定量左旋肉堿 有關。
結論
采用閥切換-非抑制型離子色譜法來測定奶制品中的 左旋肉堿，具有簡單、快速、干擾少、環保等特點。相 比常見的其它測試方法，避免了繁瑣的前處理，無需衍 生化，節約時間，重復性好，檢出限能滿足要求。該方 法可用于奶粉中左旋肉堿的含量測定。
但本方法也有不足，即無法區分左旋肉堿和右旋肉 堿，這是作者仍需繼續研究的課題之一。
