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二惡英（PCDD/Fs）是包括多氯二苯并二惡英（PCDDs）和多氯二苯并呋喃（PCDFs）在內的一類劇毒有機化合物，主要通過垃圾燃燒或作為生產有機氯農藥等特定化學物質的副產物而產生。二惡英可進入食物鏈，并長期存留從而產生生物累積。人類食用受污染食物是二惡英的主要暴露途徑。美國環境保護署認定即使僅暴露于背景值水平的二惡英，仍可能使人類罹患癌癥。因此，檢測并定量環境中，尤其是食品和動物飼料中的二惡英至關重要。

歐盟立法通過氣相色譜-高分辨質譜聯用（GC-HRMS）對污染樣本中的二惡英進行確證和定量的方法被認為是此類檢測的“金標準”。隨著近年來氣相-三重四極桿質譜聯用技術（GC-MS/MS）的不斷突破，GC-MS/MS已可實現兼顧高靈敏度和高選擇性。上述進展使得GC-MS/MS成為控制食品和飼料中二惡英高含量水平的又一有力工具。4

根據即將生效的歐盟新法規中規定，除了之前法規中有關GC-HRMS方法的標準外1,3，使用GC-MS/MS技術確證二惡英時，要求儀器必須滿足下列性能指標：4

1.每個四極桿的分辨率都不得低于單位質量分辨率（單位質量分辨率定義為能夠區分相差一個質量單位的兩個質譜峰的低分辨率）。

2.對于所有標記或未標記的分析物質的檢測均需有兩個特征母離子，每個母離子對應特定碎片子離子。

3.實測離子對相對離子強度與理論值偏差不得超過15%（校正標準物質平均值），以此確認串聯質譜狀態穩定，尤其是每個分析物質裂解過程中的碰撞能量和碰撞氣體壓力。

【實驗/設備條件】

表1.氣相色譜和進樣器參數設置

依據即將生效的歐盟對二惡英檢測的指標要求，測試中每個四極桿的分辨率均設置為單位分辨率（表2）。

表2.質譜參數設置

TSQ 8000 Evo通過采用電子電離源（EI）電離，在串聯質譜模式下工作。數據采集過程中，根據歐盟針對二惡英GC-MS/MS檢測的指標要求，每個化合物分別進行兩個離子對的選擇性反應檢（SRM）。數據通過智能定時掃描（timed-SRM）模式確保每個通道的離子流色譜峰不少于12個掃描點。每對離子對及其碰撞能量的優化均由軟件中的全自動SRM離子對優化（AutoSRM）功能自動優化完成，具體結果見表3。

數據處理應用ThermoScientific™TargetQuan 3.1軟件完成，該軟件專為日常環境中持久性有機污染物（POPs）常規定量分析而設計，可處理MS、MS/MS以及HRMS數據。

表3.天然及13C標記的二惡英類化合物的離子反應參數及碰撞能量

 

數據處理

原始數據通過TargetQuan軟件完成處理過程，該軟件可使用同位素稀釋法對持久性有機污染物（POPs）進行分析。

軟件基于相對響應因子（或平均響應因子），結合毒性當量因子（TEFs）自動計算出毒性當量（TEQs）并得出總毒性

當量。

【樣品提取】

天然及13C標記的二惡英類化合物均來自WellingtonLaboratories Inc.™。以下食品及飼料提取樣本由西班牙國家研究委員會（CSIC）下屬環境評估與水質研究所提供：三份干燥魚類樣本（之前曾用于實驗室內部其他研究），一份飼料樣本（內部標準物質）及一份奶粉樣本（認證標準物質）。飼料基質樣本的提取和凈化通過PowerPrep™固相萃取系統

完成，奶粉和魚樣本則通過多層硅膠、堿性氧化鋁柱以及活性炭柱依次手動過濾完成。

【實驗/操作方法】

本文評價了Thermo Scientific™ TSQ 8000™ Evo三重四極桿GC-MS/MS用于分析二惡英類化合物的性能表現。為此，實驗中采用標準溶液及食品、飼料樣本來評估儀器性能是否符合新的二惡英測試指標要求。同時，比較了TSQ 8000 Evo GC-MS/MS與GC-HRMS測試相同食品、飼料提取物的測試結果。

【實驗結果/結論】

Timed-SRM是一種*不同于之前“經典”的分時間段進行方法設置的分析手段，它使目標化合物的數據采集設定于已知化合物色譜保留時間附近的一段特定窗口內，而不是一個較寬的時間分段內。這樣，每個目標化合物在分析檢測器中的駐留變得，極大地提高了儀器靈敏度，降低了方法檢測限。此外，通過使用timed-SRMs還可分別檢測臨近出峰的同分異構體，例如六氯代二苯并對二惡英/呋喃類化合物（HxCDD/Fs）。圖1為應用timed-SRM與分段式SRM對靈敏度影響的比較。

 

圖1.與分段式SRM相比，timed-SRM模式對靈敏度提高比率（%）。以上數據通過比較每個二惡英類化合物的峰高（每秒計數）而得。

 

從色譜上實現二惡英類同分異構體的有效分離是以123478-HxCDF與123678-HxCDF兩峰之間峰谷高度小于25%為標準的。1本實驗中二惡英類化合物的色譜分離通過低濃度的標準溶液（EPA1613- CLS）評估。該溶液含0.1pg/µL TCDD/F、0.5 pg/µL PeCDD/F - HpCDD/F和1.0 pg/µL OCDD/F。所有天然及13C標記的待測物均檢出，且峰形良好（圖2），所有HxCDF同分異構體間峰谷高度均不超過5%。

圖2.低濃度天然二惡英標準樣品的色譜分離（括號中的濃度單位為pg/µL）。每個化合物僅展示一個SRM通道（定量離子）。

圖3.經GC分離，123478-HxCDF與123678-HxCDF兩峰之間的峰谷高度小于5%

達到期望的檢測水平

對于二惡英檢測，重要的一點就是達到期望的靈敏度。作為一個確證的方法，低定量限（LOQ）應約為高*的五分之一。1, 3, 4通常來說，考察儀器分析二惡英的靈敏度主要考慮低檢測限（LOD）和低定量限（LOQ），而對于磁質譜，上述參數則通過信噪比（S/N）值計算（LOD信噪比值為3，LOQ信噪比值為10）。

 

通過GC-MS/MS的MS/MS模式采集的數據通常沒有或只有很低的噪音，因此需要重新考慮LOD和LOQ的計算方法。假如由于技術原因，無法獲得可信的信噪比值來計算上述參數，那么計算每個化合物的LOQ應根據低濃度點（例如CSL）來計算，同時參考內標（回收率應在60-120%之間）、離子比例豐度以及色譜峰的情況。4所以，LOQ應通過低濃度標樣（CSL）以及三個相應稀釋標準溶液的多次重復進樣（n=10）測試來確定。

圖4.根據二惡英一系列的稀釋標準溶液重復進樣結果計算的LOQ。數據表明，每個待測物LOD濃度的離子比例和響應因子均符合限定要求。

 

每個化合物的LOQ計算均考慮了相關自由度的t檢驗值（99%置信），各化合物濃度以及%RSD。結果表明，二惡英類化合物的LOD在0.01-0.05 pg/µL之間，相當于CSL的1:5和1:10的稀釋液（在此濃度水平，離子比例和響應因子偏差均在±15%以內；13C標記的內標化合物回收率在60-120%之間）（圖4）。

     終實驗結果證明，TSQ 8000 Evo GC-MS/MS可對二惡英實現亞飛克級的檢測和確證，*符合新的歐盟規定要求。3

線性響應

二惡英的定量主要是基于同位素稀釋法和響應因子校正來計算的。其中，所有標準樣品的響應因子均通過外標曲線平均而得。1, 5平均響應因子%RSD是通過樣品測試序列開始和結尾時測試的兩條含六個測試點的標準曲線計算而得。所有結果%RSD在1.2-8%之間，*符合EPA關于不得大于15%的限定要求5（表4）。

 

表4.二惡英類化合物的標準曲線線性（每條曲線六個測試點）。表中展示了每個天然二惡英化合物的平均響應因子準確度（%RSD）。所有數據來自測試樣本序列開始和結尾時測試的兩套標準曲線。

 

峰面積重現性

17種二惡英的峰面積精密度考察是通過對低濃度標準溶液（CSL）多次重復進樣測試（n=16）進行的。結果表明所有化合物的%RSD值均低于所規定大15%的限值，其中，偏差大的為2378-TCDD（8.3%），偏差小的為12378-PeCDD（3.2%）（圖5）。

離子比例

樣品測試過程中還測定了17種二惡英各自的離子對離子比（IR），并將測定值與標準物質的離子比例測定值（標準樣本CSL-CS4的平均值）做比較。測試結果表明，樣本中所有待試物質的IR與標準物質IR偏差均小于15%，符合歐盟對二惡英測試的規定標準4（圖6）。

圖5.標準曲線低濃度點（濃度范圍0.1-1.0 pg/µL）重復進樣（n=16）的峰面積重現性。虛線標明大容許偏差范圍為15%。

圖6. 17種二惡英在樣本提取物中的離子比例與標準樣品（CSL-CS4）計算得出的平均離子比例值比較

樣本提取物中的二惡英定量

進行二惡英定量測試的樣本提取物是由巴塞羅那的CSIC制備的。在實驗色譜條件下所有作為空白對照的基質樣本中均未發現明顯的基質干擾。圖7為2378-TCDD的離子流色譜圖。

通過測試每個樣本，計算出樣本中的二惡英類化合物各單體含量（單位為WHO-PCDD/F-TEQ pg/g），并與應用GC-HRMS測試相同樣本所獲數據進行比較。從結果來看，TSQ8000 Evo與GC-HRMS測試所得的數據結果較為一致（圖8-圖10）。

圖7. 2378-TCDD與其內標13C-2378-TCDD在魚（a）、飼料（b）和奶粉（c）樣本中的提取離子流色譜圖。圖中所標的為樣本中的化合物濃度（pg/g）。

圖8.飼料樣本中各二惡英類化合物分別通過TSQ 8000 Evo和GC-HRMS測試所得含量（TEQ pg/g）比較。

圖9.奶粉樣本中各二惡英類化合物分別通過TSQ 8000 Evo和GC-HRMS測試所得含量（TEQ pg/g）比較。

圖10.魚樣本中各二惡英類化合物分別通過TSQ 8000 Evo和GC-HRMS測試所得含量（TEQ pg/g）比較。

比較TSQ 8000 Evo和磁質譜測試數據計算出每個樣本中的總二惡英含量值，偏差不超過5%（圖11）。每種基質樣本中的二惡英大限值（ML）和處置限值（AL）亦被標出。2

Z-Score結果

為了檢查TSQ 8000 Evo GC-MS/MS測試結果的準確性，對所有魚樣本進行了Z-Score檢驗（這些樣本曾用于實驗室內部其他測試）。通過每個樣本的公議值（例如總二惡英含量值）、測定值及相應的標準偏差值進行檢驗計算。檢驗結果顯示，通過GC-MS/MS測試的所有魚樣本數據的Z-Score值均在±2限值以內，平均值為-0.8（圖12）。

圖11. TSQ 8000 Evo測試各樣本中總二惡英含量值與GC-HRMS測試值偏差（%）。

圖12.魚樣本的Z-Score通過將公議TEQ值的±20%作為目標標準偏差值進行計算。

 

結論

綜上所述，本次實驗證明TSQ 8000 Evo GC-MS/MS是二惡英常規分析的有力工具，*符合即將生效的歐盟法規對于二惡英在食品和飼料中的確證要求。

本次測試結果充分展示了TSQ 8000 Evo GC-MS/MS作為一臺高靈敏度和高選擇性的儀器，可以*勝任食物和飼料中二惡英的檢測和確證工作。

TSQ 8000 Evo GC-MS/MS搭配TRACE 1310氣相色譜儀和TargetQuan 3.1數據處理及報告軟件可系統化解決復雜樣本中的二惡英分析問題。

儀器在測試標準樣品和實際樣品提取物時均展示出了出色的重現性、線性、靈敏度和選擇性。

基質樣本中二惡英的TEQ計算值與磁質譜一致，充分證明了本儀器系統對于二惡英常規確證分析的可靠性。